四君子湯對脾虛大鼠腸黏膜TFF3蛋白表達及TFF3mRNA表達的影響

張 博，竇逾常，王垂杰

（1.遼寧中醫藥大學，遼寧 沈陽110032；2.吉林大學中日聯誼醫院，吉林 長春130033；

3.遼寧中醫藥大學附屬醫院，遼寧 沈陽110033）

祖國醫學認為，脾主運化，為后天之本，氣血生化之源。脾為人體正常生命活動提供必需的營養物質，維持人體的內外平衡。脾虛是全身性的綜合病理狀態，與消化系統疾病發生的關系最為密切，主要表現為消化系統功能的減退和紊亂等。脾虛狀態下，腸道黏膜屏障功能紊亂，出現病理性損傷[1]。三葉因子（TFFs，Trefoilfactors）是一族富含半胱氨酸的小分子多肽。其中小腸三葉因子（TFF3或ITF）具有很強的細胞保護作用，能促進胃腸黏膜細胞增殖，還能同胃腸黏液中的糖蛋白結合、穩定黏液屏障，因而在減輕腸道損害，促進腸道修復方面占據重要地位[2]。四君子湯是臨床上用于脾虛證治療的代表方劑，本研究通過觀察脾虛大鼠腸黏膜TFF3蛋白表達及TFF3mRNA表達的變化，及四君子湯對其影響，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物分組

SPF級SD大鼠20只，體重250g左右。雌雄各半，分籠，標準飼料喂養1周后按隨機數字表法分成4組，即正常對照組、脾虛模型組、自然復健組和四君子湯組。除正常對照組外，其余3組均制作大鼠長期脾虛模型。① 正常對照組大鼠常規喂養，生理鹽水4ml／（次·只）灌胃，隔日1次，共7周。②脾虛模型組大鼠小承氣湯（1.5ml／100g）灌胃，當日禁食不禁水，隔日1次，同時隔日足量喂食且游泳至耐力極限1次（以口鼻首次沒入水中為準），共7周。③自然復健組喂養方法前4周同脾虛模型組，4周后改為常規飼養，共7周。④四君子湯組喂養方法前4周同脾虛模型組；4周后改為常規飼養，同時用四君子湯灌胃3周，（1.5ml／100g），每日1次。于實驗7周末處死大鼠后取材處理。于實驗7周末處死大鼠，取出3cm回腸黏膜組織，用0.9% 生理鹽水沖洗干凈，冰上刮取腸黏膜，放至內－80℃冰箱保存備用。

1.2 主要儀器與試劑

電子天平，JY5002型，0.01g－500g，上海精密科學儀器有限公司生產。電子天平，BS223S型，0.001g－220g，北京賽多利斯儀器系統有統公司生產。電熱恒溫培養箱，HH·B11·500型，上海躍進醫療器械廠生產。微量移液器，美國熱電公司生產。PCR儀，BIO－RAD型，美國BIO公司生產。電泳儀，北京六一儀器設備廠生產。

總RNA 提取試 劑、RT－PCR 試 劑 盒、DNA marker購自北京全式金生物技術有限公司。引物由北京三博遠志生物科技有限公司代為合成。親和純化兔抗大鼠多克隆抗體購自美國santa公司，羊抗兔二抗、蛋白marker購自北京全式金生物技術有限公司。小承氣湯由厚樸、枳實、大黃（比例3∶3∶2）組成；四君子湯由黨參、白術、茯苓、甘草（比例2∶2∶2∶1）組成，均由遼寧中醫藥大學附屬醫院藥劑科提供，并由該院制劑室制成100%煎劑。

1.3 測定方法

1.3.1 腸黏膜TFF3蛋白表達的測定

蛋白印跡（Western－Blot）法測定回腸組織中TFF3蛋白表達的變化：按組織凈重與裂解液1∶10的比例加入蛋白提取試劑，并用玻璃勻漿器在冰上進行勻漿，勻漿后靜置于冰上20min，10 000轉／分進行離心，離心15min，分離上清液即為總蛋白備用。采用考馬斯亮藍法對各組總蛋白進行蛋白定量，每孔上樣20μg總蛋白進行電泳，半干轉印法將蛋白轉至PVDF膜，一抗（1∶200）4℃孵育過夜、二抗（1∶2 000）室溫孵育1h，ECL發光，膠片曝光，掃描膠片，分別測定目的蛋白條帶和內參蛋白條帶灰度值，以目的條帶灰度值／內參條帶灰度值比值作為統計量，分析蛋白表達情況。

1.3.2 TFF3mRNA表達的測定

采用RT－PCR方法對各組大鼠回腸黏膜組織TFF3mRNA表達水平進行檢測：TFF3上游引物5－AGCCCAGGAATTTGTTGGCC－3，下游引物5－TCAAAATGTACATTCTGTCT－3，擴增片段長度184bp。以GAPDH做為內參，（基因號：X02231），GAPDH 游 引 物 為 5′GCTGGTGCTGAGTATGTCGT，下游引物5′GAATGGGAGTTGCTGTTGAA，擴增片段長度608bp。凝膠成像分析系統采集圖像，并測定目的基因條帶和內參基因條帶的積分光密度值，以目的條帶積分光密度值／內參基因積分光密度值的比值作為統計數據，進行TFF3mRNA表達水平分析。

1.4 統計學方法

應用SPSS10.0軟件進行統計學處理。所測得數據均以“均數±標準差”（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 與空白對照組相比，脾虛各組腸組織中TFF3蛋白的表達均有下降，其中四君子湯組TFF3蛋白的表達高于自然復健組及脾虛模型組，差異有統計學意義 （P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠回腸組織中TFF3蛋白的表達

2.2 與空白對照組相比，脾虛各組腸組織中TFF3 mRNA的表達均下降，其中四君子湯組TFF3mRNA的表達優于自然復健組及長期脾虛模型組，差異有統計學意義 （P＜0.01）。見表2，圖1。

表2 各組大鼠回腸組織中TFF3mRNA的表達

圖1 各組大鼠回腸組織中TFF3mRNA的表達

3 討論

腸三葉因子（TFF3或ITF intestinal trefoil factor）是三葉肽家族成員之一，由腸黏膜上皮杯狀細胞分泌，廣泛存在于胃腸道，與MUC2等在腸黏膜中相互鏈接，在黏膜中構成網絡狀結構，抵抗胃腸道酸流，蛋白酶降解和機械損傷，從而保護腸黏膜免受損害[3]。同時，TFF3可以驅動受損黏膜周圍完好的上皮細胞向黏膜損傷表面遷移覆蓋，加速損傷修復，且TFF3較EGF引起的細胞遷徙，能減少細胞間隙的產生，更能精密修復黏膜損傷部位[4]，保持腸黏膜完整。TFF3能促進NF－κB的活性，從而增強ICE－18細胞的抗凋亡能力；而PI3－K／Akt途徑促進了TFF3和MUC2在小腸上皮細胞的表達，TFF3又能反過激活PI3－K／Akt途徑，以此來下調Caspase－3／9的活性[5]。研究表明，TFF3在抑制腸道黏膜凋亡、杯狀細胞的分化中也起著重要作用，從而對黏膜起到保護作用。另外，有研究發現，TFF3可能通過促進環氧化酶－2合成，繼而促進前列腺素－2生成，從而避免氧化應激對上皮細胞的損傷，來發揮細胞保護作用[6]。借助Scr和激活STAT3誘導血管內皮生長因子表達，有助于細胞的重建[7]。TFF3被認為是內源性具有抗凋亡特性的肽類物質，在腸道的自我保護和損傷后修復中占有重要地位。

脾虛證大鼠出現胃腸黏膜上皮局灶壞死脫落，炎性滲出，胃腺、腸腺萎縮，腸黏膜上皮壞死脫落。上皮細胞內含有大量自噬泡，腺體萎縮。黏膜下層水腫，細胞排列疏松。腸黏膜微絨毛排列稀疏紊亂，長短不一[8]。黏膜上皮內淋巴細胞和杯狀細胞數量均顯著增加，絨毛頂端與黏膜下層TLR2表達量均顯著降低[9]。證明脾虛大鼠腸黏膜存在病理器質性損傷，進而可能引起腸黏膜功能損害。

本文觀察到與空白對照組相比，脾虛各組大鼠腸黏膜TFF3蛋白表達及TFF3mRNA表達顯著下調，這提示脾虛狀態下大鼠腸黏膜病理器質性損傷，防御能力減弱。四君子湯組經治療后TFF3蛋白表達及TFF3mRNA表達明顯增加，優于自然復健組及長期脾虛模型組，提示四君子湯可增強TFF3mRNA與蛋白的表達，這一結果也表明四君子湯能夠促進受損腸黏膜細胞的修復，增強腸黏膜防御能力。從而對腸黏膜屏障發揮調節作用。

[1]曾 星，賀 毅，周 丹，等.甘草對脾虛證消化道黏膜及細胞保護的分子藥理機制研究進展[J].時珍國醫藥，2010，21（8）：2030.

[2]Xue L，Aihara E，Podolsky D K，et al.In vivo action of trefoil factor 2（TFF2）to speed gastric repair is independent of cyclooxy－genase[J].Gut，2010，59（9）：1184.

[3]R J Longman，J Douthwaite.Coordinated localisation of mucins and trefoil peptides in the ulcer associated cell lineage and the gastrointestinal mucosa[J].Gut，2000，792.

[4]Dürer U，Hartig R，Bang S，et al.TFF3and EGF induce different migration patterns of intestinal epithelial cells in vitro and trigger increased internalization of E－cadherin[J].Cell PhysiolBiochem ，2007，20：329.

[5]Durual S，Blanchard C，Perrot V，et al.Expression of human TFF3in relation to growth of HT－29cell subpopulations：involvement of PI3－K but not STAT6[J].Differentiation，2005，73：36.

[6]Tan XD，Chen YH，Liu QP，et al.Prostanoids mediate the protective effect of trefoil factor 3in oxidant－induced intestinal epithelial cell injury：role of cyclooxygenase－2[J].J Cell Sci，2000，113（Pt 12）：2149.

[7]Rivat C，Rodrigues S，Bruyneel E，et al.Implication of STAT3 signaling in human colonic cancer cells during intestinal trefoil factor 3（TFF3）and vascular endothelial growth factor mediated cellular invasion and tumor growth[J].Cancer Res，2005，65：195.

[8]姚永莉，宋于剛，趙 彤，等.大鼠脾虛證模型的胃腸黏膜形態學研究[J].中國中西醫結合脾胃雜志，2000，8（1）：8.

[9]尹 朋，趙 燁，朱曉宇，等.實驗性脾虛大鼠小腸結構與免疫功能的變化[J].中國獸醫雜志，2010，46（1）：16.