二甲亞砜對外周血單個核細胞增殖能力和細胞因子分泌功能的影響

羅光成，易婷婷，劉素蘭，張國元，張 君，蔣興亮

（川北醫學院附屬醫院 檢驗科，四川 南充637000）

二甲基亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）是溶解性極好的有機溶劑之一，既是科研實驗中配制試劑時的常用助溶劑，也是目前最好的細胞凍存保護劑。因此，DMSO在科研實驗中應用非常廣泛，但研究表明DMSO本身對細胞也存在一定的毒性作用，可能影響細胞生長和功能［1－3］。外周血單個核細胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMCs）是機體免疫系統的重要組成部分之一，是T、B淋巴細胞、巨噬細胞、NK細胞等免疫活性細胞的集合體，在機體免疫反應中起至關重要的作用。PBMCs參與眾多疾病的的發生發展過程，特別是HIV、HBV、HCV和結核等感染性疾病中發揮著重要作用。因此，在一些疾病的研究過程中，PBMCs也常常作為實驗對象，或者被長期深低溫保存。然而，在科研實驗中廣泛使用的DMSO是否對PBMCs的功能產生影響呢？本研將對此問題進行探討。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

抽取5例健康成年人外周血10ml，密度梯度離心法分離獲取PBMCs。分別在含有0.5%、1%、2%、4%、8%DMSO的培養條件下，檢測PBMCs的增殖能力和細胞因子分泌功能。

1.2 主要試劑和儀器

DMSO、PHA、RPMI 1640、淋巴細胞分離、胎牛血清和牛血清白蛋白購自Sigma公司；Anti－CD3和Anti－CD28購自BD公司；IFN－γELISPOT試劑盒購自BioRad公司；FACS CantoⅡ流式細胞儀購自BD公司；ELISPOT reader購自BIOSYS公司。

1.3 單個核細胞的分離

采集受試者外周靜脈血10ml，并肝素抗凝；用RPMI1640稀釋至20ml；緩緩加到兩支含5ml淋巴細胞分離液的離心管中，離心2 000rpm×20 min；收集淋巴細胞分離液上的云霧狀的PBMCs層，并臺盼藍染色計數，以備后續試驗用。

1.4 CFSE染色檢測PBMCs增殖能力

以活細胞熒光標記物羥基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺脂（Carboxyl Fluorescein Diacetate Succinimidyl Ester，CFSE）為細胞增殖示蹤物，Anti－CD3和 Anti－CD28（Anti－CD3/28）為刺激物，并最終用流式細胞儀分析PBMCs增殖情況。CFSE染色檢測細胞增殖的具體步驟如下：（1）取適量分離到的新鮮PBMCs，用0.1%BSA－PBS將細胞濃度調整至1×107/ml，與等體積4.0μmol/ml的 CFSE混合，37℃避光染色8min。（2）加入等體積的胎牛血清，37℃避光溫育10min，以終止染色反應。離心棄上清，再用0.1%BSA－PBS洗滌三次。（3）用含不同濃度DMSO的R10培養基（含90%的RPMI1640和10%的FBS）重懸PBMCs，以2×105的細胞數鋪板，并加入刺激物anti－CD3/28，37℃、5%CO2孵育5天。（4）收集細胞并流式細胞儀檢測。采集到的流式數據采用FlowJo分析軟件分析數據，其中細胞增殖強度通過軟件自帶的增殖分析工具計算得出，用Divided%表示。

1.5 ELISPOT檢測PBMCs細胞因子分泌功能

該實驗以植物血凝素（Phytohaemagglutinin，PHA）為刺激物，采用IFN－γELISPOT技術檢測PBMCs細胞因子分泌功能。具體步驟如下：①包被：用PBS稀釋IFN－γ單克隆抗體（1∶1 000），以50μl/孔加入ELISPOT板的微孔中，4℃冰箱過夜。②封閉：棄掉微孔中包被液，用無菌PBS洗滌6次。然后每孔加入200μl R10，室溫封閉60min。③用含不同濃度DMSO的R10將PBMCs重懸PBMCs，并調至4×106/ml。④棄去封閉液，每培養孔加50μl細胞懸液和50μl 4μg/ml的PHA，將ELISPOT板于培養箱，37℃5%CO2孵育18－24h，棄培養液并洗滌6次。⑤1∶1000稀釋生物素化的INF－γ多克隆抗體，并每孔加50μl，室溫孵育4h，棄二抗并洗滌6次。⑥1∶1 000稀釋酶標親和素，并每孔加50μl，室溫孵育60min，棄酶標液并洗滌6次。⑦加顯色液：加入新鮮配制的顯色液100μl/孔，室溫避光顯色15－30min，ELISPOT reader讀板，計算斑點形成細胞（spot－forming cells，SFC）。

1.6 統計學方法

數據處理應用SPSS13.0統計軟件，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著差檢驗（least significant difference，LSD），P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DMSO對PBMCs增殖功能的影響

采用CFSE染色示蹤PBMCs、流式細胞術檢測分析增殖細胞比例，實驗結果如圖1和表1所示，在含有不同濃度DMSO的培養環境下，PBMCs具有不同的增殖能力。在含有0.5%、1%的DMSO的培養環境中，與不含DMSO的對照組相比，PBMCs的增殖能力無顯著改變，差異無統計學意義（P＞0.05）。而在含有2%、4%、8%DMSO的環境中，PBMCs的增殖能力受到了明顯的抑制，與對照組相比差異有統計學意義（P＜0.01）。

2.2 DMSO對PBMCs細胞因子分泌能力的影響

采用IFN－γELISPOT技術檢測DMSO對PBMCs分泌IFN－γ的影響，結果顯示：在含有0.5%、1%、2%的DMSO的培養環境中，PBMCs的細胞因子分泌功能無顯著改變，差異無統計學意義（P＞0.05）；而在含有4%、8%DMSO的環境中，PBMCs的細胞因子分泌功能受到了明顯的抑制，與對照組相比差異有統計學意義（P＜0.05）。這一結果表明，高濃度的DMSO同樣對PBMCs的細胞因子分泌功能和增殖能力有著相似影響。如圖2和表1所示。

圖1 DMSO對PBMCs增殖功能的影響

表1 不同濃度DMSO對PBMCs的增殖和細胞因子分泌能力的影響

圖2 DMSO對PBMCs細胞因子分泌能力的影響

3 討論

DMSO是科研實驗中常用的助溶有機化合物和最好的細胞凍存保護劑，關于它對不同種類細胞體外培養的生長抑制和細胞毒作用，國內外已有一些報道［1－5］。已有的研究表明DMSO對細胞的毒性效應與細胞種類、作用濃度和作用時間明顯相關。E－ter等［5］人的研究表明，15.5μl/ml的 DMSO 能明顯抑制毛細血管內皮細胞的體外增殖；Oz等［1］人報道，1.4μM/ml的DMSO對小鼠乳腺癌細胞有明顯的細胞毒性作用；Liu等人［2］的研究結果顯示，2%的DMSO對中國倉鼠卵巢細胞系細胞的生長有明顯的抑制作用。彭坤等人［4］的研究顯示，10ml/L的DMSO作用48h即可抑制人視網膜色素上皮生長，其抑制作用隨濃度增加和作用時間延長更加顯著。然而，關于DMSO對PBMCs及其細胞亞群的影響，目前鮮有報道。在PBMCs的功能研究過程中，其增殖能力和分泌活性細胞因子的能力是研究者非常關心的問題。特別是在感染性疾病的研究過程中，IFN－γ因其作為清除感染的效應細胞因子而廣受關注。

CFSE是一種用于示蹤細胞增殖過程的活細胞熒光染料，通過流式細胞儀檢測其熒光強度的變化進來反應細胞增殖情況。ELISPOT是一種在單細胞水平檢測細胞因子分泌功能的檢測技術。目前，CFSE示蹤技術和ELISPOT技術分別是檢測細胞增值功能和細胞因子分泌能力的主要方法之一［6－8］。在Anti－CD3/28和PHA的刺激下，淋巴細胞可分別發生增殖和分泌細胞因子。因此，本文采用CFSE示蹤技術和IFN－γELISPOT技術，分別檢測DMSO對PBMCs增殖能力和細胞因子分泌功能的影響。我們的研究結果顯示，DMSO在培養體系中的體積分數為2% 時，PBMCs的增殖功能開始受到明顯抑制，與對照組相比差異有統計學意義（P＜0.01）；而當培養體系中的DMSO的濃度為4%時，PBMCs分泌細胞因子的功能開始受到明顯抑制，與對照組相比差異有統計學意義（P＜0.05）；并且，從圖1A和圖2A可以看出，DMSO對PBMCs增殖和細胞因子分泌功能的影響存在良好的濃度依賴趨勢。這與韓大良、葛成等人的研究結果相似［3，9，10］，韓大良的結果表明，當DMSO濃度大于2%時，小鼠骨髓基質細胞和內皮細胞系細胞的細胞活力和活細胞率受到明顯抑制，并且葛成也證明DMSO濃度大于2%就可以對大鼠成骨細胞的活力產生明顯的抑制效應。另外，我們的研究的結果顯示，DMSO對PBMCs增殖和細胞因子分泌功能產生抑制作用的起始濃度是不一致的，分別為2%和4%。這表明，DMSO的細胞毒性作用不僅在不同細胞種類之間存在差異，即使在同種細胞的不同檢測指標之間也有所差異。

綜上所述，當培養體系中DMSO濃度大于2%，就會對PBMC產生明顯的細胞毒性作用，且其細胞毒性作用隨濃度的增加而增加。因此，當細胞培養體系中含有DMSO時，應當考慮DMSO濃度、細胞種類和培養時間等因素，參照已有研究結果并且進行預實驗，采取適當措施或減小規避DMSO對實驗結果的影響。

［1］Oz ES，Aydemir E，Fiskin K.DMSO exhibits similar cytotoxicity effects to thalidomide in mouse breast cancer cells［J］.Oncol Lett，2012，3（4）：927.

［2］Liu CH，Chen LH.Promotion of recombinant macrophage colony stimulating factor production by dimethyl sulfoxide addition in Chinese hamster ovary cells［J］.J Biosci Bioeng，2007，103（1）：45.

［3］韓大良，劉克清，郭少三，等.二甲亞砜、吐溫80對小鼠骨髓來源細胞體外生長和活力影響的量效關系分析［J］.中國實驗血液學雜志，2008，12（2）：377.

［4］彭 坤，邢怡橋，項 奕，等.二甲基亞砜對培養人視網膜色素上皮細胞增殖的影響［J］.眼科新進展，2004（02）：91.

［5］Eter N，Spitznas M.DMSO mimics inhibitory effect of thalidomide on choriocapillary endothelial cell proliferation in culture［J］.Br J Ophthalmol，2002，86（11）：1303.

［6］邱趁麗，張春濤，王佑春，等.ELISpot分析技術發展、實驗標準化及應用進展［J］.中華檢驗醫學雜志，2010，33（8）：712.

［7］Rehermann B，Naoumov N V.Immunological techniques in viral hepatitis［J］.J Hepatol，2007，46（3）：508.

［8］張 娟，蔣 俊，張 紅，等.結核分枝桿菌 Ag85A/MPT－64融合基因DNA疫苗的構建及免疫研究中ELISPOT技術的應用［J］.中國實驗診斷學，2012，16（1）：20.

［9］葛 成，楊連甲，劉寶林.脲和二甲基亞砜對體外培養鼠成骨細胞活性和功能的影響［J］.現代康復，2001（20）：48.

［10］韓 剛，李金龍，賈明庫.CpG ODN誘導人PBMC對結腸癌細胞體外殺傷作用的研究［J］.中國實驗診斷學，2011，15（1）：89.