埃博霉素產生菌的純化及其意義

任閃閃+劉延霆+楊聯合+趙博宇+牛春玲

隨著比紫杉醇臨床效果更佳的埃博霉素被發現，埃博霉素的產生菌——纖維堆囊菌日益引起重視，本文通過對其純化方法進行探索，簡化純化步驟，縮短純化周期，為埃博霉素的進一步研究奠定基礎。

埃博霉素 纖維堆囊菌 分離純化

目前最為知名的抗腫瘤藥物非紫杉醇莫屬。但由于紫杉醇提取于紅豆杉，而紅豆杉又數量有限，后續資源不足，因此尋找與紫杉醇的代替者就顯得尤為重要。埃博霉素（Epothilones）與紫杉醇的作用機制相同，埃博霉素A、B和D對癌細胞的生物活性與紫杉醇相當，甚至更強，尤其是埃博霉素B，其活性比紫杉醇強10-100倍.但其水溶性更高，分子量更小，結構更簡單，對紫杉醇抗性的腫瘤細胞也有抗性。埃博霉素來源于粘細菌的纖維堆囊菌屬。但由于粘細菌不能以單細胞的形態進行生長且生長緩慢，因此分離純化困難，純化周期長，因此進一步探索粘細菌尤其是纖維堆囊菌的快速分離純化顯得尤為重要。

1材料與方法

1.1土樣

采集河南中醫學院的土樣及腐殖質。

1.2主要試劑和儀器設備

常規試劑自上海生工；提取DNA相關試劑，PCR相關試劑均購自于北京天根生物公司。主要儀器設備：體式顯微鏡stekeo discovery V8；倒置顯微鏡DP73 TH4-200等。

1.3分離、純化所需的培養基

CNST培養基：KNO3 0.5 g/L，Na2HPO4 0.25 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，FeCl3 0.01 g/L，微量元素液1mL，pH 7.2。

1.4方法

1.4.1土樣采集的標準及初步處理

將采集的有機質含量豐富（富含其它微生物）的土壤樣品，自然風干后研成粉末狀，平鋪在滅過菌的平皿中，用配成適當濃度的制霉菌素液（1片/50mL無菌水）過夜處理，干燥后二次處理，將二次處理后干燥的土樣裝入滅過菌的離心管中待用。

1.4.2纖維堆囊菌分離富集純化及驗純

纖維堆囊菌的分離富集一般用CNST培養基。配制CNST滅菌后待其冷卻至不燙手時，加入30～40U經過過濾除菌的放線菌酮液，≤40U的青霉素，5～20U的慶大霉素，≤40U的卡那霉素，≤100U的氨芐青霉素，凝固后，貼上1.5～2cm見方的滅菌濾紙片，每皿4張，倒置平板，在超凈臺中放置1-2天后除去培養基水汽。

將土樣研碎后，適量勻撒在濾紙片上，每個CNST平板接一個土樣。先在30℃的培養箱中培養一周，之后將接有土樣的平板置于室溫下繼續培養，在解剖鏡下堅持每天觀察，如果濾紙片變橘紅或者橙紅色或者有菌膜出現則用接種鏟將變色部分（此為纖維堆囊菌的子實體部分）或菌膜轉接至新的平板上。對于纖維堆囊菌的純化，主要是在顯微鏡下轉接其子實體或菌膜，具體方法為：先將在顯微鏡下觀察到的較純的菌膜或子實體的位置在平皿底部標出，之后在超凈臺中用注射器轉接至新的加有各種抗生素的CNST平板上，多次轉接后（此時霉菌的量大大減少），對菌體（主要是子實體）進行洗滌。

對于染菌嚴重的子實體，用過濾好的放線菌酮配成溶液，具體濃度是0.05mg/mL，分裝至各個1.5mL的離心管中，然后在離心管中接入染菌子實體，于56～57℃水浴3～4h（個別染菌嚴重的子實體可以提高水浴溫度，但不能超過57℃），之后將子實體轉接至新的平板，待菌重新長出。如果仍有染菌，可以多次重復此步驟。直至可以長出完整透明的菌膜。

1.4.3纖維堆囊菌DNA的提取

采用CTAB法提取菌株DNA，并適當稀釋作為模板，進行PCR擴增菌株16S rDNA序列。所用引物為細菌常用引物：27f和1492r。PCR 擴增程序為：94℃ 5min；94℃ 1min；58℃ 1min；72℃ 3min；30 cycles；72℃ 10min；4℃保溫。

2實驗結果

2.1纖維堆囊菌的分離純化——形態觀察

可以觀察到子實體在濾紙上大量堆積，培養基中3～5成團，20～200μm，呈黃色、橙紅色、棕黃色、鐵銹色、黑色；營養細胞呈圓柱狀，末端鈍圓，長2.5～10μm；粘孢子在形態上與營養細胞區別小，長1～3μm；其擴展菌膜輻射狀或扇狀，邊緣通常有樹枝狀或其它不規則突起。如圖1，符合纖維堆囊菌形態學上的特征。

A B

C

圖1 不同生長周期的纖維堆囊菌（5×）

A在濾紙上剛剛完成富集；B擴展到濾紙邊緣的營養細胞；C營養細胞在瓊脂上完成富集，形成大量子實體

2.2纖維堆囊菌的分離純化-分子生物學鑒定

純化的纖維堆囊菌16S rDNA序列與NCBI上的基因序列相比較，相似性都在98%以上。

3討論

結合纖維堆囊菌特殊的生長特點：（1）菌體細胞可聚集形成肉眼可見的子實體結構；（2）在貧瘠的培養基上易形成擴展的菌落；（3）粘細菌的子實體或粘孢子具有較高的耐熱性。本文創新性地使用了抗生素洗滌法與高溫處理法相結合，大大提高了純化效率。制霉菌素抑制霉菌的效果很好，但其水溶性較差，而將二甲亞砜作為溶劑加入培養基中又嚴重影響纖維堆囊菌的生長且有刺激性氣味。故有必要找出能夠替代制霉菌素的抗生素，最終發現用水溶性較好且相對濃度較高的放線菌酮對子實體進行洗滌，可以達到同樣的抑制霉菌的效果。結合纖維堆囊菌的子實體耐高溫這一相對優勢生理特點對其進行高溫水浴，在抑制甚至殺死其它雜菌的同時又不影響纖維堆囊菌的生長。

通過此方法，使纖維堆囊菌的純化時間由之前的半年甚至一年縮短至一到兩個月。相對于微生物的傳統純化方法和粘細菌的其他純化方法，本文的試驗方法簡單高效，為纖維堆囊菌資源提供更加豐富和多樣的研究材料，同時也為大量獲得埃博霉素（Epothilones）及其結構類似物提供更多的原始產生菌。

參考文獻：

[1]Gerth K，B.N.， Hoffe C，et al.，EpothiJones A and B：Antifungal and Cytotoxic Compounds from Sorangium cellulosum （Myxobacteria）[J].J Antibiot，1996，（49）：560-563.endprint

隨著比紫杉醇臨床效果更佳的埃博霉素被發現，埃博霉素的產生菌——纖維堆囊菌日益引起重視，本文通過對其純化方法進行探索，簡化純化步驟，縮短純化周期，為埃博霉素的進一步研究奠定基礎。

埃博霉素 纖維堆囊菌 分離純化

目前最為知名的抗腫瘤藥物非紫杉醇莫屬。但由于紫杉醇提取于紅豆杉，而紅豆杉又數量有限，后續資源不足，因此尋找與紫杉醇的代替者就顯得尤為重要。埃博霉素（Epothilones）與紫杉醇的作用機制相同，埃博霉素A、B和D對癌細胞的生物活性與紫杉醇相當，甚至更強，尤其是埃博霉素B，其活性比紫杉醇強10-100倍.但其水溶性更高，分子量更小，結構更簡單，對紫杉醇抗性的腫瘤細胞也有抗性。埃博霉素來源于粘細菌的纖維堆囊菌屬。但由于粘細菌不能以單細胞的形態進行生長且生長緩慢，因此分離純化困難，純化周期長，因此進一步探索粘細菌尤其是纖維堆囊菌的快速分離純化顯得尤為重要。

1材料與方法

1.1土樣

采集河南中醫學院的土樣及腐殖質。

1.2主要試劑和儀器設備

常規試劑自上海生工；提取DNA相關試劑，PCR相關試劑均購自于北京天根生物公司。主要儀器設備：體式顯微鏡stekeo discovery V8；倒置顯微鏡DP73 TH4-200等。

1.3分離、純化所需的培養基

CNST培養基：KNO3 0.5 g/L，Na2HPO4 0.25 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，FeCl3 0.01 g/L，微量元素液1mL，pH 7.2。

1.4方法

1.4.1土樣采集的標準及初步處理

將采集的有機質含量豐富（富含其它微生物）的土壤樣品，自然風干后研成粉末狀，平鋪在滅過菌的平皿中，用配成適當濃度的制霉菌素液（1片/50mL無菌水）過夜處理，干燥后二次處理，將二次處理后干燥的土樣裝入滅過菌的離心管中待用。

1.4.2纖維堆囊菌分離富集純化及驗純

纖維堆囊菌的分離富集一般用CNST培養基。配制CNST滅菌后待其冷卻至不燙手時，加入30～40U經過過濾除菌的放線菌酮液，≤40U的青霉素，5～20U的慶大霉素，≤40U的卡那霉素，≤100U的氨芐青霉素，凝固后，貼上1.5～2cm見方的滅菌濾紙片，每皿4張，倒置平板，在超凈臺中放置1-2天后除去培養基水汽。

將土樣研碎后，適量勻撒在濾紙片上，每個CNST平板接一個土樣。先在30℃的培養箱中培養一周，之后將接有土樣的平板置于室溫下繼續培養，在解剖鏡下堅持每天觀察，如果濾紙片變橘紅或者橙紅色或者有菌膜出現則用接種鏟將變色部分（此為纖維堆囊菌的子實體部分）或菌膜轉接至新的平板上。對于纖維堆囊菌的純化，主要是在顯微鏡下轉接其子實體或菌膜，具體方法為：先將在顯微鏡下觀察到的較純的菌膜或子實體的位置在平皿底部標出，之后在超凈臺中用注射器轉接至新的加有各種抗生素的CNST平板上，多次轉接后（此時霉菌的量大大減少），對菌體（主要是子實體）進行洗滌。

對于染菌嚴重的子實體，用過濾好的放線菌酮配成溶液，具體濃度是0.05mg/mL，分裝至各個1.5mL的離心管中，然后在離心管中接入染菌子實體，于56～57℃水浴3～4h（個別染菌嚴重的子實體可以提高水浴溫度，但不能超過57℃），之后將子實體轉接至新的平板，待菌重新長出。如果仍有染菌，可以多次重復此步驟。直至可以長出完整透明的菌膜。

1.4.3纖維堆囊菌DNA的提取

采用CTAB法提取菌株DNA，并適當稀釋作為模板，進行PCR擴增菌株16S rDNA序列。所用引物為細菌常用引物：27f和1492r。PCR 擴增程序為：94℃ 5min；94℃ 1min；58℃ 1min；72℃ 3min；30 cycles；72℃ 10min；4℃保溫。

2實驗結果

2.1纖維堆囊菌的分離純化——形態觀察

可以觀察到子實體在濾紙上大量堆積，培養基中3～5成團，20～200μm，呈黃色、橙紅色、棕黃色、鐵銹色、黑色；營養細胞呈圓柱狀，末端鈍圓，長2.5～10μm；粘孢子在形態上與營養細胞區別小，長1～3μm；其擴展菌膜輻射狀或扇狀，邊緣通常有樹枝狀或其它不規則突起。如圖1，符合纖維堆囊菌形態學上的特征。

A B

C

圖1 不同生長周期的纖維堆囊菌（5×）

A在濾紙上剛剛完成富集；B擴展到濾紙邊緣的營養細胞；C營養細胞在瓊脂上完成富集，形成大量子實體

2.2纖維堆囊菌的分離純化-分子生物學鑒定

純化的纖維堆囊菌16S rDNA序列與NCBI上的基因序列相比較，相似性都在98%以上。

3討論

結合纖維堆囊菌特殊的生長特點：（1）菌體細胞可聚集形成肉眼可見的子實體結構；（2）在貧瘠的培養基上易形成擴展的菌落；（3）粘細菌的子實體或粘孢子具有較高的耐熱性。本文創新性地使用了抗生素洗滌法與高溫處理法相結合，大大提高了純化效率。制霉菌素抑制霉菌的效果很好，但其水溶性較差，而將二甲亞砜作為溶劑加入培養基中又嚴重影響纖維堆囊菌的生長且有刺激性氣味。故有必要找出能夠替代制霉菌素的抗生素，最終發現用水溶性較好且相對濃度較高的放線菌酮對子實體進行洗滌，可以達到同樣的抑制霉菌的效果。結合纖維堆囊菌的子實體耐高溫這一相對優勢生理特點對其進行高溫水浴，在抑制甚至殺死其它雜菌的同時又不影響纖維堆囊菌的生長。

通過此方法，使纖維堆囊菌的純化時間由之前的半年甚至一年縮短至一到兩個月。相對于微生物的傳統純化方法和粘細菌的其他純化方法，本文的試驗方法簡單高效，為纖維堆囊菌資源提供更加豐富和多樣的研究材料，同時也為大量獲得埃博霉素（Epothilones）及其結構類似物提供更多的原始產生菌。

參考文獻：

[1]Gerth K，B.N.， Hoffe C，et al.，EpothiJones A and B：Antifungal and Cytotoxic Compounds from Sorangium cellulosum （Myxobacteria）[J].J Antibiot，1996，（49）：560-563.endprint

隨著比紫杉醇臨床效果更佳的埃博霉素被發現，埃博霉素的產生菌——纖維堆囊菌日益引起重視，本文通過對其純化方法進行探索，簡化純化步驟，縮短純化周期，為埃博霉素的進一步研究奠定基礎。

埃博霉素 纖維堆囊菌 分離純化

目前最為知名的抗腫瘤藥物非紫杉醇莫屬。但由于紫杉醇提取于紅豆杉，而紅豆杉又數量有限，后續資源不足，因此尋找與紫杉醇的代替者就顯得尤為重要。埃博霉素（Epothilones）與紫杉醇的作用機制相同，埃博霉素A、B和D對癌細胞的生物活性與紫杉醇相當，甚至更強，尤其是埃博霉素B，其活性比紫杉醇強10-100倍.但其水溶性更高，分子量更小，結構更簡單，對紫杉醇抗性的腫瘤細胞也有抗性。埃博霉素來源于粘細菌的纖維堆囊菌屬。但由于粘細菌不能以單細胞的形態進行生長且生長緩慢，因此分離純化困難，純化周期長，因此進一步探索粘細菌尤其是纖維堆囊菌的快速分離純化顯得尤為重要。

1材料與方法

1.1土樣

采集河南中醫學院的土樣及腐殖質。

1.2主要試劑和儀器設備

常規試劑自上海生工；提取DNA相關試劑，PCR相關試劑均購自于北京天根生物公司。主要儀器設備：體式顯微鏡stekeo discovery V8；倒置顯微鏡DP73 TH4-200等。

1.3分離、純化所需的培養基

CNST培養基：KNO3 0.5 g/L，Na2HPO4 0.25 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，FeCl3 0.01 g/L，微量元素液1mL，pH 7.2。

1.4方法

1.4.1土樣采集的標準及初步處理

將采集的有機質含量豐富（富含其它微生物）的土壤樣品，自然風干后研成粉末狀，平鋪在滅過菌的平皿中，用配成適當濃度的制霉菌素液（1片/50mL無菌水）過夜處理，干燥后二次處理，將二次處理后干燥的土樣裝入滅過菌的離心管中待用。

1.4.2纖維堆囊菌分離富集純化及驗純

纖維堆囊菌的分離富集一般用CNST培養基。配制CNST滅菌后待其冷卻至不燙手時，加入30～40U經過過濾除菌的放線菌酮液，≤40U的青霉素，5～20U的慶大霉素，≤40U的卡那霉素，≤100U的氨芐青霉素，凝固后，貼上1.5～2cm見方的滅菌濾紙片，每皿4張，倒置平板，在超凈臺中放置1-2天后除去培養基水汽。

將土樣研碎后，適量勻撒在濾紙片上，每個CNST平板接一個土樣。先在30℃的培養箱中培養一周，之后將接有土樣的平板置于室溫下繼續培養，在解剖鏡下堅持每天觀察，如果濾紙片變橘紅或者橙紅色或者有菌膜出現則用接種鏟將變色部分（此為纖維堆囊菌的子實體部分）或菌膜轉接至新的平板上。對于纖維堆囊菌的純化，主要是在顯微鏡下轉接其子實體或菌膜，具體方法為：先將在顯微鏡下觀察到的較純的菌膜或子實體的位置在平皿底部標出，之后在超凈臺中用注射器轉接至新的加有各種抗生素的CNST平板上，多次轉接后（此時霉菌的量大大減少），對菌體（主要是子實體）進行洗滌。

對于染菌嚴重的子實體，用過濾好的放線菌酮配成溶液，具體濃度是0.05mg/mL，分裝至各個1.5mL的離心管中，然后在離心管中接入染菌子實體，于56～57℃水浴3～4h（個別染菌嚴重的子實體可以提高水浴溫度，但不能超過57℃），之后將子實體轉接至新的平板，待菌重新長出。如果仍有染菌，可以多次重復此步驟。直至可以長出完整透明的菌膜。

1.4.3纖維堆囊菌DNA的提取

采用CTAB法提取菌株DNA，并適當稀釋作為模板，進行PCR擴增菌株16S rDNA序列。所用引物為細菌常用引物：27f和1492r。PCR 擴增程序為：94℃ 5min；94℃ 1min；58℃ 1min；72℃ 3min；30 cycles；72℃ 10min；4℃保溫。

2實驗結果

2.1纖維堆囊菌的分離純化——形態觀察

可以觀察到子實體在濾紙上大量堆積，培養基中3～5成團，20～200μm，呈黃色、橙紅色、棕黃色、鐵銹色、黑色；營養細胞呈圓柱狀，末端鈍圓，長2.5～10μm；粘孢子在形態上與營養細胞區別小，長1～3μm；其擴展菌膜輻射狀或扇狀，邊緣通常有樹枝狀或其它不規則突起。如圖1，符合纖維堆囊菌形態學上的特征。

A B

C

圖1 不同生長周期的纖維堆囊菌（5×）

A在濾紙上剛剛完成富集；B擴展到濾紙邊緣的營養細胞；C營養細胞在瓊脂上完成富集，形成大量子實體

2.2纖維堆囊菌的分離純化-分子生物學鑒定

純化的纖維堆囊菌16S rDNA序列與NCBI上的基因序列相比較，相似性都在98%以上。

3討論

結合纖維堆囊菌特殊的生長特點：（1）菌體細胞可聚集形成肉眼可見的子實體結構；（2）在貧瘠的培養基上易形成擴展的菌落；（3）粘細菌的子實體或粘孢子具有較高的耐熱性。本文創新性地使用了抗生素洗滌法與高溫處理法相結合，大大提高了純化效率。制霉菌素抑制霉菌的效果很好，但其水溶性較差，而將二甲亞砜作為溶劑加入培養基中又嚴重影響纖維堆囊菌的生長且有刺激性氣味。故有必要找出能夠替代制霉菌素的抗生素，最終發現用水溶性較好且相對濃度較高的放線菌酮對子實體進行洗滌，可以達到同樣的抑制霉菌的效果。結合纖維堆囊菌的子實體耐高溫這一相對優勢生理特點對其進行高溫水浴，在抑制甚至殺死其它雜菌的同時又不影響纖維堆囊菌的生長。

通過此方法，使纖維堆囊菌的純化時間由之前的半年甚至一年縮短至一到兩個月。相對于微生物的傳統純化方法和粘細菌的其他純化方法，本文的試驗方法簡單高效，為纖維堆囊菌資源提供更加豐富和多樣的研究材料，同時也為大量獲得埃博霉素（Epothilones）及其結構類似物提供更多的原始產生菌。

參考文獻：

[1]Gerth K，B.N.， Hoffe C，et al.，EpothiJones A and B：Antifungal and Cytotoxic Compounds from Sorangium cellulosum （Myxobacteria）[J].J Antibiot，1996，（49）：560-563.endprint