肝細胞癌腫瘤血管生成及其臨床病理意義

劉明閣，于慶凱

(河南省腫瘤醫院病理科 河南鄭州 450003)

實體瘤的生長和轉移依賴于血管的生成，肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是富血供的腫瘤，因此影響血管發生及生長的影響因子對HCC的診斷及治療具有重要意義［1］。近幾年來，細胞因子及腫瘤血管形成對腫瘤影響的研究越來越受到重視，本研究主要針對兩個因子、一個指標與HCC的關系進行探討。兩個因子:血管組織缺氧誘導因子-1α(Hypoxiainducible factor-1α，HIF-1α)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF);一個指標:微血管密度(microvessel density，MVD)。其中，根據 CD34陽性的血管內皮細胞計數來測定MVD［2］。本研究旨在探討HIF-1α的表達、VEGF的表達、MVD之間的相互作用，及其對HCC的病理學意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取河南省腫瘤醫院肝膽外科2012年4月至2013年5月期間手術切除并經病理證實HCC的標本66例，其中男性42例，女性24例;年齡36～69歲，平均53.3歲;腫瘤直徑≤5 cm 21例，＞5 cm 45例;腫瘤組織發生轉移39例，未發生轉移27例;按照臨床分期:Ⅰ～Ⅱ期41例，Ⅲ～Ⅳ期25例。所有標本均經本院病理科進行固定、脫水、浸蠟、包埋、切片、貼片、染色、封片等常規步驟。處理步驟、方法之間差異無統計學意義。

1.2 實驗方法 標本切片采用免疫組化染色技術，具體流程如下:①甲醛固定，4℃，20%蔗糖溶液過夜;②制作蠟塊:常規浸蠟、包埋、切片、貼片操作，PBS清洗(清洗5 min，重復3次);③使用0.3%的過氧化氫甲醇溶液處理30 min，PBS清洗同②;④加入配好的0.3%Triton X-100 溶液處理30 min，PBS清洗同②;⑤加入血清稀釋液稀釋的一抗，4℃處理24～48 h，吸去抗體，PBS清洗同②;⑥加入PBS處理的二抗，室溫處理2 h，PBS清洗同②;⑦加入抗體，室溫處理2 h，PBS清洗同②，蒸餾水迅速沖洗3次;⑧加入顯色液，進行免疫組織化學顯色操作，酒精梯度脫水后，透明、封片、拍照。

1.3 結果判定 HIF-1α經免疫組化染色后，著色部位主要位于胞漿，陽性細胞鏡下顯示棕黃色顆粒。每計數100個細胞，細胞數大于10記為陽性，無陽性細胞或細胞數小于10記為陰性。VEGF經免疫組化染色后，胞質和胞膜中均可出現棕黃色顆粒，鏡下陽細胞數≥30%者記為陽性，＜30%以及無著色者記為陰性。根據CD34陽性的血管內皮細胞計數來測定腫瘤微血管密度(MVD)。首先，在低倍鏡下進行初步掃片，選擇3個血管豐富的區域作為分析區域。然后，在高倍鏡下(×200)計數被染成棕黃色的內皮細胞團簇數目。最后，取3個區域的平均值作為該組織的MVD值［3］。

1.4 統計學處理 所有資料采用SPSS 17.0統計學軟件處理，定量資料采用t檢驗，定性資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 HIF-1α、VEGF的表達及 MVD值比較 HCC組織的HIF-1α、VEGF表達及MVD值均顯著增高，癌癥組織與癌旁非腫瘤組織的差異有統計學意義(P＜0.05)。見表1、表2。

表1 肝細胞肝癌與癌旁非腫瘤組織HIF-1α、VEGF表達陽性率對比［n，(%)］

表2 肝細胞肝癌與癌旁非腫瘤組織MVD值對比(±s)

表2 肝細胞肝癌與癌旁非腫瘤組織MVD值對比(±s)

組別 n MVD值＜0.05 66 40.82±21.40癌旁非腫瘤組織 20 22.20±11.83 t 3.713 P肝細胞癌

2.2 不同病理特征下HIF-1α、VEGF的表達及MVD值的比較 HIF-1α、VEGF、MVD在肝細胞肝癌中的表達與腫瘤大小、AFP值的高低、病理分級無關(P＞0.05)。轉移組HIF-1α、VEGF的表達明顯高于未轉移組(P＜0.01);轉移組MVD值顯著高于未轉移組(P＜0.01)。見表3、表4。

表3 不同病理特征下HIF-1α、VEGF表達的比較

表4 不同病理特征下MVD值的比較研究(±s)

表4 不同病理特征下MVD值的比較研究(±s)

t P腫瘤直徑組別 n MVD值1.594 0.112≤5 cm 21 47.11±18.26＞5 cm 45 39.10±19.29 AFP 0.426 0.672≤400 μg/L 20 45.70±6.80＞400 μg/L 46 44.90±7.10腫瘤轉移6.517＜0.01

續表4

3 討論

肝細胞肝癌是全球發病率較高的疾病之一，由于其病情發展迅速、治療難度大、預后效果差，已成為臨床上主要的研究課題［4］。近年來，有學者提出，由于HCC具有豐富的血管供應，其腫瘤血管生成可能與HCC的發生發展有關［5］。因此，本研究對腫瘤血管及其相關因子對HCC的影響進行探討。

研究認為，MVD值最能夠充分反映HCC腫瘤血管的發生、發展過程，本研究以CD34陽性的血管內皮細胞計數來測定MVD值，對其表達及影響因素進行研究。結果顯示，MVD在腫瘤組織中具有高表達，且MVD值的高低與腫瘤是否發生轉移密切相關，而與腫瘤直徑、AFP值及病理分期無關。因此可以推斷MVD值可以反映HCC腫瘤血管的生成，并可以作為腫瘤是否發生轉移的評價指標。有文獻表明MVD能夠直接反應腫瘤血管的生成狀況，間接反映腫瘤的生長情況、發生浸潤和轉移的能力［6］，因此本研究結果與文獻報道一致。

由于HCC為富血供的實體瘤，缺氧情況明顯，并且腫瘤血管的生成需要各種因子的刺激，HIF-1α為重要的缺氧調節因子，VEGF為重要的誘導血管生成的調節因子［7］。因此，本研究對 HIF-1α、VEGF 兩個因子進行探討，并嘗試分析兩者與MVD值之間的關系。本研究顯示:HCC組織的HIF-1α、VEGF的表達顯著高于癌旁非腫瘤組織，在發生轉移的組織中HIF-1α、VEGF的表達顯著高于未發生轉移的組織(P＜0.05)，且與腫瘤直徑、AFP值及病理分期無關(P＞0.05)。此結果說明HIF-1α、VEGF是HCC腫瘤血管生成重要的調節因子，在臨床工作中應給予重視。

此次研究中將MWD值、HIF-1α、VEGF的表達放在一起進行比較，結果顯示三者的表達呈正相關，因此可以推斷MVD受HIF-1α、VEGF表達的影響與調控，均與肝癌的發生、發展、轉移有關。在臨床治療中可以通過減少或抑制HIF-1α、VEGF的表達來減緩腫瘤發展及轉移的過程。

另外，本研究中，HIF-1α、VEGF在HCC組織中的表達率分別為83.33%、81.08%，且在發生轉移的腫瘤組織中均具有高表達，因此可以推測，HIF-1α與VEGF的表達兩者之間可能有相關性，兩者相互促進，共同調控腫瘤血管的生成，其臨床意義有待進一步研究。

［1］Sato Y.Is vasohibin-1 for more than angiogenesis inhibition［J］.Journal of Biochemistry，2011，149(3):229-230.

［2］Lu C，Han H D，Mangala L S，et al.Regulation of tumorangiogenesis by EZH2［J］.Cancer cell，2010，18(2):185-197.

［3］Zhang L，Wang J N，Tang J M，et al.VEGF is essential for the growth and migration of human hepatocellular carcinoma cells［J］.Molecular biology reports，2012，39(5):5085-5093.

［4］Choedon T，Dolma D，Kumar V.Pro-apoptotic and anticancer properties of Thapring-A Tibetan herbal formulation［J］.J Ethnopharmacology，2011，137(1):320-326.

［5］Okamoto K，Neureiter D，Ocker M，et al.Biomarkers for novel targeted therapies of hepatocellular carcinoma［J］.Histol Histopathol，2009，24(4):493-502.

［6］Patel N S，Muneer A，Blick C，et al.Targeting vascular endothelial growth factor in renal cell carcinoma［J］.Tumour Biol，2009，30(5-6):292-299.

［7］Liu Y，Chen Z，Liu C，et al.Gadolinium-loaded polymeric nanoparticles modified with Anti-VEGF as multifunctional MRI contrast agents for the diagnosis of liver cancer［J］.Biomaterials，2011，32(22):5167-5176.