白藜蘆醇對(duì)AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和海馬P-tau表達(dá)的影響

王景方， 伊紅麗， 袁曉玲， 劉力峰， 夏章勇， 郭存舉

白藜蘆醇(Resveratrol，Res)是一類主要存在于葡萄、藜蘆、虎杖等植物中的非黃酮類多酚類化合物，其結(jié)構(gòu)與合成的雌激素類化合物己烯雌酚(Diethylstilbestrol，DES)類似，與雌激素受體有較高的親和力，被認(rèn)為是一種植物雌激素［1］，并能防止雌激素替代治療出現(xiàn)的嚴(yán)重副作用。研究發(fā)現(xiàn)Res對(duì)阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)小鼠認(rèn)知功能具有一定保護(hù)作用，并能改善AD小鼠的抗氧化能力［2］。目前，關(guān)于Res對(duì) AD動(dòng)物模型的干預(yù)作用機(jī)制報(bào)道很少，本實(shí)驗(yàn)以Aβ誘導(dǎo)制備AD大鼠模型，給予AD大鼠白藜蘆醇，觀察大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改變及海馬組織形態(tài)學(xué)變化、P-tau表達(dá)的變化，探討白藜蘆醇改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用雄性清潔級(jí)SD大鼠50只，體重170～210 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)0001406。置于室溫25±2℃，12/12 h晝夜循環(huán)光照條件下生活，自由攝食、飲水。

1.1.2 藥品與試劑 Res(陜西慈緣生物技術(shù)有限公司，純度 99%，批號(hào) 030120)，Aβ25～35(Sigma公司，批號(hào)109K5794)，兔抗Tau多克隆抗體及SP免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)20120612)。

1.1.3 儀器 雙臂數(shù)字式腦立體定位儀(德國(guó)艾德儀器公司，型號(hào)68004)，OLYMPUS生物顯微鏡(日本奧林巴斯公司，型號(hào)BX45)，Image-Pro Plus 5.1圖像處理軟件。

1.2 方 法

1.2.1 模型制備 大鼠用 10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉后，固定于腦立體定位儀上，頭頂部正中切口暴露前囟，參照大鼠腦立體定位圖譜［3］，以前囟為原點(diǎn)，向后 4.4 mm，旁開 2.2 mm為穿刺點(diǎn)，顱鉆穿孔，自顱骨表面進(jìn)針3.0 mm至雙側(cè)海馬，用微量注射泵將1μl(10μg)Aβ25～35在5 min內(nèi)緩慢注入，留針5 min，以使Aβ25～35充分浸潤(rùn)局部組織，假手術(shù)組注射等量的生理鹽水。退針后縫合傷口，縫合前撒少許青霉素鈉粉末，縫合后用碘酒消毒，術(shù)后腹腔注射青霉素鈉防止感染，連續(xù)3 d。常規(guī)飼養(yǎng)。

1.2.2 動(dòng)物分組及給藥 大鼠隨機(jī)分為5組:假手術(shù)組、AD模型組、Res(高、中、低劑量)治療組，每組10只。造模3 d后，Res治療組分別灌胃給予88 mg/(kg·d)，44 mg/(kg·d)，22 mg/(kg·d)，連續(xù)21 d。假手術(shù)組和模型組灌胃等量的三蒸水連續(xù)21 d。

1.2.3 水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察大鼠學(xué)習(xí)記憶能力術(shù)后12 d進(jìn)行通道式水迷宮訓(xùn)練，上、下午各訓(xùn)練1次，共7 d。訓(xùn)練時(shí)選擇一個(gè)入水點(diǎn)，將大鼠面向池壁放入水中，觀察并記錄各大鼠進(jìn)入盲端次數(shù)和到達(dá)終點(diǎn)所需時(shí)間，訓(xùn)練期間水溫在(25±2)℃，迷宮外參照物保持一致。將各組7 d的成績(jī)進(jìn)行比較。

1.2.4 取材 各組大鼠灌胃21 d后，10%水合氯醛(300mg/kg)，腹腔注射麻醉，快速剪開胸廓，捏住心臟，于心尖處剪一小口，插入灌注針頭到主動(dòng)脈，止血鉗固定，剪開右心耳，快速滴入氯化鈉150 ml，再注入4%多聚甲醛300 ml，取腦，浸入固定液中，待用。

1.2.5 免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接(Streptavidin-Perosidase，SP)法檢測(cè)海馬P-tau蛋白的表達(dá) 3%H2O2室溫孵育10 min滅活內(nèi)源性過氧化物酶;0.01 mol/L PBS(磷酸鹽緩沖液)溶液(pH為6.0)微波熱修復(fù)抗原;滴加一抗(1:500)，37℃水浴箱孵育40 min;滴加辣根過氧化物酶(Horse Radish Peroxidase，HRP)標(biāo)記的免疫球蛋白G(Immunoglobulin G，IgG)抗體，37℃水浴箱孵育20 min;二氨基聯(lián)苯胺(3，3’-diaminobenzidine，DAB)顯色;放入自來水中終止顯色，蘇木精輕度復(fù)染，脫水，封片。每張切片在顯微鏡下隨機(jī)取4個(gè)高倍視野觀察海馬 CA1、CA2、CA3、CA4區(qū)域并拍照。神經(jīng)元胞質(zhì)及突起內(nèi)染棕黃色為P-tau陽(yáng)性表達(dá)，采用Image-ProPlus5.1圖像處理軟件統(tǒng)計(jì)積分光密度(Itegral Optical Density，IOD)。

1.2.6 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色觀察大鼠海馬組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化 按照HE染色的步驟進(jìn)行染色，光學(xué)顯微鏡觀察海馬組織形態(tài)學(xué)變化并拍照。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用 SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以χ±s表示，統(tǒng)計(jì)采用單因素方差分析，多組樣本均數(shù)之間兩兩比較采用LSD分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對(duì)AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響動(dòng)物在水迷宮游出時(shí)間越短，錯(cuò)誤次數(shù)越少反映動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力越強(qiáng)。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠游出時(shí)間和錯(cuò)誤次數(shù)明顯增加(P＜0.01)，與模型組相比，Res高劑量組和中劑量組大鼠游出時(shí)間和錯(cuò)誤次數(shù)明顯下降(P＜0.05)(見表1)。

2.2 白藜蘆醇對(duì)AD大鼠海馬組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化的影響 各組大鼠海馬組織神經(jīng)元變化:假手術(shù)組大鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞著色均勻?yàn)闇\藍(lán)紫色，排列緊密，胞核完整，核仁深染;模型組大鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞層數(shù)和數(shù)量減少，細(xì)胞間隙變大，排列紊亂，部分細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞核固縮，并有破裂，整個(gè)細(xì)胞深染成紅色;高、中劑量組神經(jīng)細(xì)胞著色均勻，排列較緊密;低劑量組神經(jīng)元胞質(zhì)濃染，數(shù)量較模型組增多(見圖1)。

2.3 各組大鼠海馬組織P-tau的表達(dá) 假手術(shù)組大鼠海馬組織P-tau未見明顯表達(dá);模型組大鼠海馬組織P-tau表達(dá)呈強(qiáng)陽(yáng)性;Res高劑量組大鼠海馬組織P-tau表達(dá)不明顯;中劑量組大鼠海馬組織P-tau表達(dá)輕度;低劑量組大鼠海馬組織P-tau表達(dá)中度(見圖2)。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬內(nèi)P-tau積分光密度(IOD)明顯增加(P＜0.01);與模型組比較，Res高、中劑量組大鼠海馬內(nèi)P-tau積分光密度明顯降低(P＜0.01)(見表2)。

圖2 各組大鼠海馬組織P-tau的表達(dá)(免疫組化SP法，×400)

表1 白藜蘆醇對(duì)AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響(χ±s)

表2 白藜蘆醇對(duì)AD大鼠海馬組織P-tau表達(dá)的影響(χ±s)

3 討論

AD是慢性進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性病導(dǎo)致的癡呆，以漸進(jìn)性記憶障礙、認(rèn)知功能障礙、人格改變及語言障礙等神經(jīng)精神癥狀為特征。病理改變主要為皮質(zhì)彌漫性萎縮、溝回增寬、腦室擴(kuò)大、神經(jīng)元大量減少，并可見老年斑(Senile plaque，SP)、神經(jīng)原纖維纏結(jié)(Neurofibrillary tangles，NFT)等病變［4］。AD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，當(dāng)前研究關(guān)于AD的發(fā)病機(jī)制主要有微管相關(guān)蛋白異常學(xué)說、淀粉樣肽假說、膽堿能損傷學(xué)說、基因突變學(xué)說、內(nèi)分泌失調(diào)學(xué)說、炎癥反應(yīng)等。在微管相關(guān)蛋白異常學(xué)說中，NFT是AD的主要損傷，是由神經(jīng)元纖維異常聚集形成。AD中主要的纖維結(jié)構(gòu)是雙股螺旋纖維，其核心的主要成分為微管相關(guān)蛋白的tau蛋白，tau蛋白是一種分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的低分子量含磷糖蛋白，它可以與神經(jīng)軸突內(nèi)的微管結(jié)合，并且具有誘導(dǎo)與促進(jìn)微管蛋白聚合成微管、防止微管解聚和維持微管功能的穩(wěn)定的作用。當(dāng)tau蛋白發(fā)生高度磷酸化，這使tau蛋白喪失同微管的結(jié)合能力，破壞了細(xì)胞骨架系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)，同時(shí)導(dǎo)致自身的聚集而形成雙股螺旋纖維。過度磷酸化tau(P-tau)蛋白是NFT的主要成分，臨床病理研究發(fā)現(xiàn)AD患者的癡呆癥狀嚴(yán)重程度與腦組織中NFT數(shù)量呈正相關(guān)，提示tau蛋白過度磷酸化與 AD 發(fā)病相關(guān)［5，6］。

白藜蘆醇是一種天然的抗氧化劑，可降低血液粘稠度，抑制血小板凝結(jié)和血管舒張，保持血液暢通，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病，調(diào)節(jié)血脂及抗低密度脂蛋白氧化的作用，還具有雌激素樣作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與假手術(shù)組相比，模型組大鼠游出時(shí)間、錯(cuò)誤次數(shù)以及海馬內(nèi)P-tau積分光密度均明顯增加，且海馬組織神經(jīng)細(xì)胞層數(shù)和數(shù)量減少;與模型組相比，Res高劑量組和中劑量組大鼠游出時(shí)間、錯(cuò)誤次數(shù)以及海馬內(nèi)P-tau積分光密度均明顯降低，且海馬神經(jīng)細(xì)胞著色均勻，排列較緊密。研究揭示白藜蘆醇可改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，減少海馬神經(jīng)元丟失，其作用可能是通過降低海馬P-tau的表達(dá)，從而減少老年斑和神經(jīng)纖維纏結(jié)實(shí)現(xiàn)的。不論給予高、中、低劑量的Res均可改善AD大鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力，且有明顯的量效關(guān)系。總之，本研究為Res在雌激素替代治療AD中的作用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為進(jìn)一步尋找有效措施，充分降低P-tau的蛋白表達(dá)，最終改善學(xué)習(xí)和記憶的能力提供新的思路。本研究不足主要為樣本量太小，有待于擴(kuò)大樣本及相關(guān)檢測(cè)指標(biāo)以進(jìn)一步探討。

［1］張學(xué)景，鄒 永，鐘榮清，等.白藜蘆醇的雌激素樣作用及其治療的相關(guān)意義［J］.中國(guó)新藥雜志，2004，13(8):692-695.

［2］林 茂，萬 章，王春梅.白藜蘆醇對(duì)阿爾茨海默病小鼠記憶和抗氧化能力的影響［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2009，18(5):484-486.

［3］Paxinos G，Watson C.The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates.San Diego［M］，CA:Academic，1997.1-79.

［4］王維治.神經(jīng)病學(xué)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2008.1397-1400.

［5］蔡 標(biāo)，申國(guó)明，汪遠(yuǎn)金，等.大豆異黃酮對(duì)AD大鼠海馬Apo-E4的影響［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，13(7):117-119.

［6］魯遠(yuǎn)君，余昌胤.阿爾茨海默病中針對(duì)tau蛋白治療的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志，2008，15(3):211.