BMP-7對大鼠腦缺血再灌注損傷后Caspase-9表達的影響

裴海濤， 曹東明， 李紅云， 郭壯麗

骨形態發生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7，BMP-7)是β轉化生長因子(TGF-β)超家族中的一員，廣泛應用于開放性骨折及脊柱融合術中［1］。近年研究發現，大鼠腦缺血后，BMP-7能夠通過血腦屏障達缺血側腦組織，并且促進大鼠神經功能恢復［2］。體外細胞培養證實，BMP-7能抑制低鉀引起的神經細胞凋亡，具有抗凋亡作用［3］。動物實驗研究表明，BMP-7可抑制大鼠大腦中動脈缺血再灌注后的細胞凋亡，但是其作用機制仍十分不清楚［4］。細胞凋亡是腦缺血再灌注損傷的重要機制，主要由特異性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)介導，其中Caspase-9是細胞凋亡線粒體通路的重要啟動酶［5］。本實驗通過觀察BMP-7對大鼠腦缺血再灌注損傷后Caspase-9表達的影響，探討其對腦缺血再灌注損傷的保護機制。

1 材料與方法

1.1 材料 成年清潔級雄性Wistar大鼠50只，體質量230～250 g，［青島市實驗動物和動物實驗中心提供，許可證號:SCXK(魯)20090007。兔抗鼠Caspase-9一抗(Abcam，美國);BMP-7(北京博奧森);免疫組化試劑盒(北京博奧森);SYBR Green Real-time PCR試劑盒和逆轉錄試劑盒(TAKARA，日本);BCA蛋白定量試劑盒(江蘇碧云天);Trizol(Invitrogen，美國);Caspase-9引物由上海生工合成。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 實驗前將動物置于實驗室適應環境1 w，自由進食、飲水，室溫(23±2)℃，自然光照，術前禁食12 h。參考Longa等［6］方法，應用線栓法經左側頸外-頸內動脈插線建立缺血2 h再灌注24 h模型。術中和術后用恒溫電熱毯保持動物肛溫36℃～37℃。以大鼠術后麻醉清醒后出現左側Honer征、提尾右側上肢屈曲、爬行時向右側轉圈者為模型成功的標志，假手術組插線10 mm后即刻退出，其余操作同手術組。

1.2.2 動物分組和給藥方法 將實驗動物隨機分為4組:假手術組、模型組、BMP-7低劑量組(0.1 mg/kg)、BMP-7 高劑量組(0.2 mg/kg)，每組10只。治療組在缺血2 h后經尾靜脈給予不同劑量BMP-7(250μl)，假手術組和模型組同步給予等體積的生理鹽水。

1.2.3 神經功能評分 大鼠缺血再灌注后，按照Longa等［2］5分法，進行神經功能評分。0分:無明顯神經功能缺失;1分:對側前爪不能完全伸直;2分:行走時向對側旋轉;3分:行走時向對側傾倒;4分:不能自發行走，意識喪失。

1.2.4 HE染色 缺血2 h再灌注24 h后，每組各取5只大鼠，用10%水合氯醛麻醉后打開腹腔后，依次用生理鹽水、4%多聚甲醛灌注后，斷頭取腦，置于4%多聚甲醛固定。腦組織常規梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，自視交叉后連續冠狀位切片，片厚5μm。切片常規脫蠟水化，蒸餾水沖洗后，行HE染色，光學顯微鏡下觀察腦組織病理變化。

1.2.5 免疫組織化學染色 取上述石蠟切片，常規脫蠟水化，蒸餾水沖洗后，按照說明書進行Caspase-9免疫組織化學染色，光鏡下觀察胞質有棕色顆粒者為陽性細胞。部分切片不加一抗，用0.01 mmol/L PBS代替，作為陰性對照。每張切片在皮質區隨機取5個不重疊的高倍鏡視野(400×)，計數各視野陽性細胞數，取其均數。

1.2.6 實時定量RT-PCR檢測 缺血2 h再灌注24 h后，每組各取5只大鼠，快速斷頭取腦分離皮質后置于-80℃冰箱中保存。取缺血側皮質100 mg，用Trizol試劑盒說明進行總RNA的提取測定其純度及濃度。將總RNA用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄得到 cDNA。取1μl cDNA為模板，采用SYBR Green Real-time PCR試劑盒，在Bio-Rad iCycler iQ實時定量PCR儀上檢測各組Caspase-9 mRNA含量。反應體系為20μl，反應條件如下:先95℃ 60 s，再95℃ 10 s，60℃ 30 s，循環反應40次。采用2-△△Ct法比較Caspase-9在各組中的表達差異。△△Ct=目的基因的CT平均值-內參基因的CT平均值。引物應用Primer Premier軟件設計，引物序列為:Caspase-9上游引物5’-TCA CGG CTT TGA TGG AGA TG-3’，下游引物5’-AGA GAGGAT GAC CAC CAC GAA-3’;內參 GAPDH上游引物5’-GACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3’;下游引物 5’-CCA GTA GAG GCA GGG ATG ATG T-3’。

1.2.7 Western blot檢測 取-80℃保存的缺血側皮質100 mg，按1:4比例加入400μl預冷細胞裂解液中，充分研磨，4℃ 12000 r/min離心20 min，取上清液，采用BCA法進行蛋白定量，并將蛋白樣品標準化。取30μg蛋白樣品，用10%SDSPAGE電泳分離蛋白質，分離的蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上，用10%脫脂牛奶封閉1 h后加入兔抗鼠Caspase-9單克隆抗體(1:1000)，4℃孵育過夜。取出上述膜，TBST洗3次，每次15 min。在膜上加入生物素標記二抗后室溫孵育1.5 h，TBST洗膜3次后用ECL化學發光法顯色，曝光后保存圖片，以β-actin為內參，應用Quantity One分析軟件對蛋白條帶進行灰度掃描。

1.2.8 統計學處理 采用 SPSS 17.0統計軟件分析，數據以χ±s表示，多組數據采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 神經功能行為評分 假手術組無神經功能缺損癥狀，其余各組大鼠出現不同程度的神經功能缺損。BMP-7中、高劑量組神經功能評分(1.6±0.5;1.4 ±0.5)與模型組(2.8 ±0.5)相比顯著降低(t=3.79，t=4.43，P ＜0.01)。

2.2 大鼠梗死側皮質病理學變化 假手術組大鼠皮質組織結構完整，胞漿、胞核結構清晰，神經細胞、膠質細胞和毛細血管形態及分布正常(見圖1A)。模型組皮質神經細胞數量減少，胞漿、胞核界限不清，核固縮和核溶解，細胞明顯腫脹壞死(見圖1B)。與模型組相比，BMP-7治療組神經細胞數量增多，細胞形態相對規則，核固縮和核溶解減輕，水腫減輕(見圖1C)，且以BMP-7高劑量組改善最為明顯(見圖1D)。

2.3 大鼠梗死側皮質活性Caspase-9表達 疫組織化學染色顯示，假手術組大鼠皮質可觀察到少量 Caspase-9 陽性細胞(1.4 ±1.1)，模型組 Caspase-9陽性細胞數(28.8±5.2)較假手術組顯著增多(t=11.58，P ＜0.01)。與模型組相比，BMP-7 低、高劑量組Caspase-9陽性細胞數(18.8±3.3;13.2±3.7)顯著減少(t=3.19，t=5.49;P ＜ 0.05，P ＜0.01)(見圖2、圖3)。

2.4 大鼠梗死側皮質Caspase-9 mRNA的表達

實時定量RT-PCR擴增曲線顯示，各組大鼠缺血側皮質Caspase-9擴增良好。與模型組相比，BMP-7中、高劑量組 Caspase-9 mRNA 表達(2.33±0.29;1.85 ±0.32)顯著減少(t=2.56，t=4.52;P ＜0.05，P ＜0.01)(見圖4)。

2.5 大鼠梗死側皮質活性Caspase-9蛋白的表達 Western blot檢測顯示，假手術組活性Caspase-9呈很低量表達，與模型組相比，BMP-7低、高劑量組活性Caspase-9蛋白表達平均灰度值顯著降低(t=3.11，t=5.62;P ＜0.05，P ＜0.01)(見圖5)。

圖1 再灌注后大鼠腦組織病理改變(×200)

圖2 各組大鼠缺血側皮質Caspase-9陽性細胞(×400)

圖3 各組大鼠缺血側皮質Caspase-9陽性細胞計數

圖4 BMP-7對大鼠缺血側皮質Caspase-9 mRNA表達的影響

圖5 BMP-7對大鼠缺血側皮質Caspase-9蛋白表達的影響

3 討論

Liu等［7］研究發現，大鼠腦缺血再灌注損傷后，BMP-7可增加缺血后腦組織葡萄糖的利用率和血流量。Chou等［8］觀察到，BMP-7可促進梗死對側腦室下區神經祖細胞的增殖，并促使其轉移到梗死側大腦皮質周圍。本實驗研究表明，腦缺血再灌注損傷后經尾靜脈注射BMP-7可促進大鼠神經功能的恢復，病理組織學顯示BMP-7可明顯減輕大鼠腦缺血再灌后的腦損傷，維持在腦缺血狀態下神經細胞的正常形態和功能，延緩其凋亡和壞死，尤其以BMP-7高劑量組的效果最為明顯，說明BMP-7對腦缺血再灌注損傷有明顯的神經保護作用。腦缺血再灌注后觸發的一系列復雜的級聯反應，包括氨基酸毒性、自由基生成、蛋白酶激活、炎癥反應等，其最終階段均涉及到Caspase介導的細胞凋亡［9～11］。腦缺血后神經細胞凋亡主要包括Caspase參與的線粒體凋亡途徑和死亡受體凋亡途徑，其中Caspase-9是線粒體凋亡途徑的啟動酶，當凋亡信號傳至線粒體時，線粒體釋放細胞色素C(CytC)，CytC與Procaspase-9及凋亡活化因子-1(Apaf-1)結合形成凋亡體，進而使Procaspase-9發生裂解成為活性 Caspase-9，活性Caspase-9又能進一步促進下游的Caspase的激活，引發DNA的斷裂和多種蛋白成分的破壞，最終導致細胞凋亡［12］。朱炬等［13］發現大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后Caspase-9 mRNA的表達增強。Mouw等［14］研究表明，大鼠腦缺血再灌注損傷后，腦組織活性 Caspase-9的表達明顯增加，而特異性的Caspase-9抑制劑可下調活性Caspase-9的表達，抑制神經細胞凋亡，減小大鼠腦梗死體積。因此，通過拮抗Caspase-9的表達抑制細胞凋亡可對腦缺血再灌注損傷起保護作用。

本實驗顯示，大鼠缺血2 h再灌注24 h后，大鼠皮質區Caspase-9蛋白及Caspase-9 mRNA表達增強。BMP-7明顯抑制了缺血再灌注誘導的皮質區Caspase-9蛋白及Caspase-9 mRNA的表達，并且以高劑量的BMP-7效果更加明顯，提示BMP-7能夠降低Caspase-9的表達與活化從而減少腦缺血損傷后神經元的凋亡。本課題組前期實驗表明，BMP-7可下調腦組織中Caspase-3的表達，從而抑制腦缺血損傷導致的細胞凋亡［15］。因此，我們認為 BMP-7通過下調Caspase-9和Caspase-3表達，抑制線粒體凋亡途徑，來減少神經元凋亡，進而對腦缺血再灌注損傷起保護作用。但有關 BMP-7對 Caspase-9和Caspase-3上游的信號通路的影響尚缺乏相關的研究，因此我們將進一步研究Caspase-9和Caspase-3上游的信號通路，闡明BMP-7抑制神經細胞凋亡的完整信號分子傳導途徑。

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