銀杏葉提取物對牙齦卟啉菌膜泡抑制牙周膜成纖維細胞活性的影響

萬兵 張珊 趙樹娟 王國芳

牙周膜成纖維細胞是牙周組織的牙骨質再生、骨組織修復的細胞基礎。在牙周組織病變恢復過程中, 牙周組織形成的主要細胞是牙周膜成纖維細胞, 它具有較高的堿性磷酸酶活性和多向分化潛能［1］, 它的活性能夠通過堿性磷酸酶活性的高低客觀地反映。然而, 在牙周組織病損部位,牙周組織重建及再生達不到很好的效果, 主要是因為數量和來源極為有限。本次采用體外細胞培養法, 研究人牙周膜成纖維細胞活性受牙齦卟啉菌膜泡影響情況, 及銀杏葉提取物如何阻斷膜泡的生物活性, 為臨床治療牙周病提供了一種實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 ECV提取［2］及細胞培養 將菌種接種于改良模型(GAM)血液瓊脂培養基中進行培養, 對培養72 h的細菌培養物, 用超速離心法進行離心, 取上清液(含ECV)備用；取臨床上11～15歲因正畸拔除的上頜或下頜雙尖牙, 要求牙周牙體組織健康。拔牙前局部消毒。準備預冷細胞培養基(DMEM)培養液, 拔牙后立即放入同時送往實驗室。采用胰蛋白酶消化法(按1:3)傳代, 選取第5～7代細胞用于實驗觀察。

1.2 實驗方法 利用生長良好第6代細胞, 隨機分為空白對照組、膜泡組(50 μg/ml)、銀杏葉組(含GBE濃度分別為 0.1、0.01、0.001 mg/ml)+膜泡 (50 μg/ml), 每組設 4個復孔, 并分別加入上述所需藥物每孔100 μl, 置培養箱中培養48 h。取出細胞培養板棄去上清液, PBS清洗3次, 每孔加入1 g/LTriton X-100各50 μg, 4℃冷藏過夜, 在顯微鏡下觀察。

2 結果

當50 μg/ml ECV加入細胞培養物中, 人牙周膜成纖維細胞ALP的活性明顯抑制, 與對照空白組相比差異有統計學意義(P<0.01)。當加入不同濃度銀杏葉提取物時, 人牙周膜成纖維細胞ALP的活性明顯增高, 與ECV 組相比差異有統計學意義(P<0.01), 且隨ALP的活性隨銀杏葉提取物濃度的升高而增高, 具有一定的濃度依賴性, 見表1。

表1 ECV抑制人牙周膜成纖維細胞活性受銀杏葉提取物的影響(±s, n=4)

表1 ECV抑制人牙周膜成纖維細胞活性受銀杏葉提取物的影響(±s, n=4)

注：與空白對照組比較aP<0.05；bP<0.01

藥物分組 OD值((n=4, ±s)空白對照組 0.29±0.01膜泡組 0.07±0.01a膜泡+0.001 mg/ml GBE 0.16±0.02b膜泡+0.01 mg/ml GBE 0.19±0.02b膜泡+0.1 mg/ml GBE 0.24±0.01b

3 討論

牙周炎是常見的慢性感染性口腔疾病, 主要病原菌是Pg。它是游離入周圍微環境的一種外膜芽生體［3］, 其胞外膜泡經過細菌外膜向外膨。不僅透過細菌本身不能穿透的解剖屏障, 而且能達到更深的組織導致破壞, 結果使牙齒松動甚至脫落。治療牙周炎是使病變部位能有一定健康數量的牙周膜細胞(PDLCs)從而建立牙周組織的新附著, 是治療牙周炎的前提。PDLCs是牙周膜中最主要細胞, 具有大量膠原物質的分泌和合成的功能, 因此有利于病變的牙周組織的再生,有助于牙周組織的修復, 是牙周炎治療后形成牙齦與牙根面之間新附著的主要細胞來源。

本次試驗研究顯示: 50 μg/ml ECV加入人牙周膜成纖維細胞培養物中, 它的活性明顯受到抑制, 可能通過抑制牙周膜成纖維細胞的活性, 泡膜導致PDLCs數量減少, 進而在牙周組織病變修復過程中, 能夠阻止成纖維細胞向成牙骨質細胞或成骨細胞的分化, 阻礙硬組織與骨性修復的鈣化, 從而使病變的牙周組織的轉歸與修復受到影響。當50 μg/ml ECV和3種銀杏提取物不同濃度分別同時加入細胞培養物中后, 細胞的ALP活性, 說明在病變修復過程中,銀杏提取物可能通過阻斷ECV及抑制牙周膜成纖維細胞ALP的活性, 促進牙周膜成纖維細胞轉化成骨細胞, 有利于愈合病變。這一結果也為牙周病的治療提供一定的參考意義。

［1］李德懿.牙周病微生物學新探.國外醫學口腔分冊, 1986,3(15): 147-151.

［2］倪龍興, 史俊南, 陳曉玲.成人唾液對牙齦卟啉菌及其提取物毒理學作用的影響.中華微生物學和免疫學雜志, 1997, 17(1):21.

［3］高學敏.中藥學.北京: 人民衛生出版社, 1991: 345-239.