萍鄉(xiāng)地區(qū)孕婦產(chǎn)前地中海貧血篩查及基因診斷

劉紅宇，王繁，甘建玲，何蓉，鄧思媛，歐陽(yáng)寧

(萍鄉(xiāng)市婦幼保健院生殖遺傳研究室，江西 萍鄉(xiāng)337055)

地中海貧血(thalassemia簡(jiǎn)稱地貧)是人體珠蛋白基因缺失或突變而引起的一種遺傳性溶血性貧血，是我國(guó)南方最常見(jiàn)的遺傳性疾病[1，2]。在我國(guó)常見(jiàn)于廣西、海南、廣東、福建、香港、臺(tái)灣、云南、貴州、四川等地區(qū)。地貧目前尚無(wú)確切有效的治療方法，重型α-地貧多為死胎且孕婦并發(fā)妊娠高血壓綜合征，重型β-地貧需要終身依賴輸血和使用祛鐵劑，而中間型α和β地貧患者多無(wú)勞動(dòng)能力或勞動(dòng)力下降[3,4]，給家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，采用紅細(xì)胞平均體積MCV(mean corpuscular volume),平均紅細(xì)胞血紅蛋白量MCH(mean corpuscular hemoglobin)和血紅蛋白電泳對(duì)孕婦進(jìn)行地中海貧血篩查，缺口聚合酶鏈反應(yīng)(Gap-PCR)法、聚合酶鏈反應(yīng)－反向斑點(diǎn)雜交法(PCR-RDB)對(duì)高危胎兒進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷進(jìn)行基因檢測(cè)。是預(yù)防重型地中海貧血患兒出生的重要措施和方法[5]。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 2013年10月至2014年1月在我院婦?？飘a(chǎn)檢的孕婦及其丈夫共1345例，同時(shí)進(jìn)行血常規(guī)和血紅蛋白電泳分析，并對(duì)164例地貧表型陽(yáng)性者進(jìn)行基因診斷。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 MCV和MCH測(cè)定 采用日本希森美康Xi800全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀及其配套的稀釋液和溶血素試劑測(cè)定，實(shí)驗(yàn)前嚴(yán)格按照操作規(guī)程進(jìn)行質(zhì)控，標(biāo)本為2ml EDTA-K2靜脈抗凝血。

1.2.2 血紅蛋白電泳分析 采用法國(guó)Sebia公司的全自動(dòng)血紅蛋白電泳儀和按照配套的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3 地貧表型陽(yáng)性診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 α地貧表型篩查陽(yáng)性 MCV<80 f1[6]，MCH<27pg，Hb A2<2.5%，Hb F<2%，其中一項(xiàng)陽(yáng)性者。

1.3.2 β地貧表型篩查陽(yáng)性 MCV<80f1，MCH<27pg，Hb A2>3.5%，Hb F>2%，其中一項(xiàng)陽(yáng)性者。 對(duì)α或β地貧表型篩查陽(yáng)性患者，重新抽取2ml EDTA-K2靜脈抗凝血做基因診斷。

1.4 檢測(cè)方法 地中海貧血的基因診斷α和β地貧試劑盒由亞能生物技術(shù) (深圳)有限公司提供。PCR擴(kuò)增儀為HEMA9600。

1.4.1 α地貧基因缺失型診斷采用Gap-PCR法檢測(cè)-αSEA，-α3.7和-α4.2三種α珠蛋白基因常見(jiàn)缺失型。α地貧點(diǎn)突變型診斷采用PCR斑點(diǎn)反向雜交法 (PCR-RDB)檢測(cè)三種點(diǎn)突變型，包括Hb WS:CD122(CAC→CAG),Hb QS:CD125(CTG→CCG),Hb CS:CD142(TAA→CAA)。

1.4.2 β地貧基因突變型采用PCR-RDB檢測(cè)17種β常見(jiàn)突變型 CD41-42(-TTCT)，IVS2nt654(C→T)，-28(A→G)，CD17(A→T)，CD71-72(+A)，-29(A→G)，βE(GAG→AAG)，CD43(G→T)，CD27/28(+C)，CD14-15(+G)，CD31(-C) ，-32(C→A) ，-30(T→C)，IVS-Ⅰ-5(G→C)，CAP[CAP+1(A→C)/nts40-43(-AAAC)]，Int(ATG→AGG)。

2 結(jié)果

2.1 地貧表型陽(yáng)性檢出率 在1345例病人中檢出地貧表型陽(yáng)性者共164例，陽(yáng)性率占12.19%。其中α地貧表型陽(yáng)性者73例，占44.51%，β地貧表型陽(yáng)性者91例，占55.49%。

2.2 地中海貧血基因診斷的確診例數(shù) 164例表型陽(yáng)性的孕婦及其丈夫經(jīng)基因診斷后，確診為地貧患者58例，其中α地貧18例，β地貧40例。

2.3 地中海貧血基因診斷的確診率中α和β各型所占比例 在18例α地貧中--αSEA/αα雜合子16例，占 88.89%，-α3.7/αα 地貧雜合子 0例，占 0%，-α4.2/αα地貧雜合子2例，占11.11%，見(jiàn)表1。

表1 α地貧雜合子基因型(%)

在40例β地貧中CD41-42雜合子15例，IVS2nt654雜合子10例，CD17雜合子6例，-28(A→G)6例，CD71-72(+A)2例，-29(A→G)1例，這40例β地貧患者，共有6種類型β珠蛋白基因突變發(fā)生，見(jiàn)表2。

表2 β珠蛋白基因突變構(gòu)成比(%)

3 討論

地中海貧血分布于世界許多地區(qū)，東南亞是高發(fā)區(qū)之一，其中中國(guó)以廣東、廣西、四川、海南多見(jiàn)，常見(jiàn)的類型α地貧和β地貧，據(jù)現(xiàn)有流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，以上地區(qū)人群中α地貧發(fā)生率高達(dá)4～15%；β地貧約1～6%。地貧危害最嚴(yán)重的臨床類型是Hb Bart’s胎兒水腫綜合征、重型β地貧、中間型β地貧和血紅蛋白H病。

3.1 萍鄉(xiāng)地區(qū)地中海貧血的篩查 在萍鄉(xiāng)地區(qū)1345例篩查夫婦中，地貧表型陽(yáng)性檢出率為12.19% ，其中α地貧表型陽(yáng)性檢出率為44.51%，β地貧表型的陽(yáng)性檢出率為55.49%，在我院的產(chǎn)檢人群當(dāng)中，血常規(guī)的MCV和MCH常作為地貧篩查指標(biāo)，表型陽(yáng)性者再進(jìn)行血紅蛋白電泳分析以定量檢測(cè)Hb A，Hb A2和Hb F，電泳陽(yáng)性者再進(jìn)行基因確診實(shí)驗(yàn)，以減少漏診的發(fā)生。

3.2 萍鄉(xiāng)地區(qū)地中海貧血的基因診斷 經(jīng)α基因缺失型分析后，在萍鄉(xiāng)市的孕婦及其丈夫中，東南亞缺失型--αSEA/αα占主導(dǎo)地位，基因構(gòu)成比占88.89%，-α4.2/αα 地貧，即左側(cè)缺失占 11.11%，右側(cè)缺失很少出現(xiàn)。說(shuō)明在中國(guó)南方地區(qū)比如江西省萍鄉(xiāng)地區(qū)α地貧缺失型主要是東南亞型占大部分，這與有關(guān)的研究報(bào)道結(jié)果相一致[7]。1996年杜傳書(shū)等人總結(jié)了中國(guó)人β地貧基因突變頻率的高低順序如下CD41-42(-TCCT)占41.6%，IVS2nt654(C→T)占 21.8%，CD17(A→T)占 18%，β-28(A→G)占 8%，CD71/72(+A)占 3.9%，β-29(A→G)占 1.2%[8]。本文在檢測(cè)出6種基因突變類型和構(gòu)成比，大致與之相同。

3.3 萍鄉(xiāng)地區(qū)地中海貧血各型的分布特點(diǎn)及其結(jié)論 迄今為止，中國(guó)人中共發(fā)現(xiàn)了7種地貧缺失基因， 比較常見(jiàn)的有以下三種：-αSEA/αα，-α4.2/αα，-α3.7/αα。在萍鄉(xiāng)地區(qū)的1345例產(chǎn)婦及丈夫中，主要是 --αSEA/αα(88.89%)，很少部分為-α4.2/αα(11.11%)。α地貧突變型的6例患者中，無(wú)一例異常。說(shuō)明，萍鄉(xiāng)地區(qū)α地貧主要以缺失型為主，突變型比較罕見(jiàn)。β地貧主要是突變所導(dǎo)致的，目前中國(guó)人群主要有34種突變，亞能生物檢測(cè)的17種突變類型包括了常見(jiàn)的突變類型。在6例篩查結(jié)果顯示α和β復(fù)合型患者中，無(wú)一例是α和β同時(shí)存在的。因而防治地貧的主要措施是進(jìn)行篩查，并通過(guò)婚前、孕前或產(chǎn)前篩查出靜止型或輕型地貧夫婦，對(duì)于重型地貧高危胎兒進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷，阻止該病重癥患兒出生是目前國(guó)際公認(rèn)的首選預(yù)防對(duì)策[9,10]。

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