磷酸化STAT5、FOXP3在急性白血病患者骨髓中的表達及意義

張健，廖建軍，吳良銀，錢春艷，何鳳屏

(粵北人民醫院檢驗科，廣東 韶關 512025)

信號轉導和轉錄激活子(signal transducers and activator of transcriptions，STATs)是一類能與靶基因調控區DNA結合的胞質蛋白,有七個成員：STATL-4、STAT5A、STAT5B 和 STAT6,其中 STAT5廣泛表達于造血系統。檢測白血病細胞內磷酸化STAT5(P-STAT5)的水平，對進一步闡明STAT5異常活化與白血病的關系具有重要意義[1]。叉狀頭/翅膀狀螺旋轉錄因子(forkhead/winged helixtran scription factor3，FOXP3)是當前公認的調節性T細胞(Treg)特異性標記分子，在腫瘤免疫抑制及逃逸機制中起重要作用，新近研究還發現，FOXP3表達與STAT5的調控有關[2]。本研究采用蛋白磷酸化流式細胞術(flow cytometry，FCM)檢測急性白血病(Acute leukemia，AL)患者骨髓中單個核細胞核內表達的P-STAT5和FOXP3水平，探討兩者在發病中的作用及其相關性，為急性白血病的發病機制研究及分子免疫治療提供可靠依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象 2013年4月至2014年3月廣東粵北人民醫院血液內科45例急性白血病患者(AL),其中急性髓系白血病(AML)29例,急性淋巴細胞白血病(ALL)16例，患者年齡17～70歲，平均43.2歲，男性21例，女性24例。所有急性白血病患者化療前經骨髓穿刺病理檢查結合FCM免疫表型分析證實，診斷均符合張之南主編的《血液病診斷及療效標準》之國內診療標準[3]。對照組12名，男6例，女6例，年齡18～67歲，平均42.5歲，均無血液系統和免疫系統疾病。

1.2 試劑和儀器 FITC標記的抗人CD4抗體，APC標記的抗人CD25抗體,PE標記鼠抗人PY(694)STAT5單抗及其各自同型對照購自美國BD公司。PE標記的抗人FOXP3抗體及同型對照購自美國eBioscience公司。Perfix-p試劑盒(含配套的固定、溶血和透膜劑)，美國貝克曼公司。人淋巴細胞分離液，上海華精高科技有限公司。流式細胞儀(BD FACSCalibur)為美國BD公司產品。

1.3 方法 肝素抗凝管采集骨髓液2ml，用淋巴細胞分離液提取骨髓單個核細胞，調整細胞密度至1×107/ml。各取骨髓單個核細胞懸液50μl于標本試管中，加入50μl固定液(Fix buffer),振蕩搖勻后，室溫孵育10min。加入500μl Lysis solution,充分混勻后，37℃水浴箱孵育15min，待紅細胞完全裂解。加入1ml冷的洗滌液(PBS,2～6℃),離心(2000r/min,4min)棄上清后加入1ml90%甲醇冰上破膜30min，離心倒掉上清，加入100μl冷的PBS重懸細胞。胞內抗體與膜表面抗體一起孵育,STAT5實驗管加入鼠抗人PE-CY7 STAT5,對照管加入PE-CY7 MS IGG1各20μl。FOXP3實驗管加入鼠抗人FITC標記的抗人CD4抗體，APC標記的抗人CD25抗體，PE標記的抗人FOXP3抗體,對照管加入FITC標記小鼠IgG2a、APC標記小鼠IgG2a、PE標記小鼠IgG2a單抗各 20μl，孵育 30min后洗滌,離心棄上清，加入 Resuspend buffer 500μl,上機FCM 檢測,每管收集10000個細胞，記錄陽性細胞百分率。

1.4 統計學處理 采用SPSS15.0統計軟件進行分析，對正態分布的數據以(±s)表示；兩組計量均數比較用獨立樣本t檢驗，部分計量資料相關性分析采用單因素線性相關分析。各數據統計分析均以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 急性白血病各組及對照組P-STAT5、FOXP3的表達水平 AL患者組骨髓單個核細胞P-STAT5表達(2.35±0.82)%較對照組(0.58±0.16)%增高,差異具有統計學意義(P＜0.05)；AL患者組 Foxp3(3.98±1.17)%高于對照組(0.96±0.45)%，差異具有統計學意義(P＜0.05)%；AML組P-STAT5及FOXP3水平(2.51±0.91)%，(3.72±1.12)%和 ALL組 P-STAT5及FOXP3水平 (2.27±0.78)%，(4.03±1.18)%比較無顯著差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組P-STAT5、FOXP3的表達水平

2.2 急性白血病組P-STAT5與FOXP3相關性分析 線性相關性分析結果表明，AL患者P-STAT5及FOXP3水平顯著正相關(r=0.81,P<0.05)。

3 討論

急性白血病發病機制至今仍未完全明了，目前認為，造血細胞增殖、分化異常及機體抗腫瘤免疫功能受抑制，在疾病的發生、發展過程中起重要作用。STAT家族與JAK家族構成重要的JAKSTAT信號傳導途徑，在STAT家族中，STAT5由于在調節細胞增殖、分化及癌癥相關信號途徑中發揮重要的作用而引起了廣泛的關注。STAT5與白血病關系密切，Heuser等[4]的研究表明，STAT5信號傳導途徑在白血病干細胞的自我更新中起一定作用；Lewis[5]等認為STAT5可能是白血病及骨髓增殖性疾病診斷的標志分子及治療靶點；能夠抑制STAT5活化的因子可能在預防和治療癌癥方面有作用[6]。目前與STAT5相關的主要研究在動物模型、培養細胞或基因水平較多[1,7]，而STAT5被磷酸化激活后形成磷酸化STAT5(P-STAT5)進入細胞核調控靶基因表達的機理，仍在進一步研究當中[8]。我們應用蛋白磷酸化流式細胞術檢測急性白血病患者骨髓中單個核細胞核內表達的P-STAT5，觀察到AL患者組骨髓單個核細胞P-STAT5表達較對照組增高,差異具有統計學意義。國外Ikezoe等[9]發現P-STAT5在 AML患者CD34+CD38-細胞的表達高于CD34+CD38+細胞,國內劉炳楠等[10]在骨髓增生異常綜合征(MDS)患者骨髓細胞內同樣發現與增殖有關的P-STAT5增高，我們的結果與他們的發現相近且可相互補充，完善了在P-STAT5在惡性血液病方面研究的實驗數據。

FOXP3又稱叉狀頭/翅膀狀螺旋轉錄因子，是新發現的調節性T細胞(Treg)特異性分子標記，作為一種轉錄抑制因子，FOXP3決定了Treg細胞的免疫抑制功能[11]。近年來大量研究認為白血病的發病與腫瘤的免疫逃逸有關，在慢性白血病中FOXP3陽性Treg細胞數明顯高于正常人[12]，吳小建等[13]發現骨髓增生異常綜合征進展與FOXP3表達水平密切相關。我們在急性白血病骨髓細胞發現FOXP3表達水平明顯高于對照組，差異具有統計學意義，進一步證實FOXP3水平的升高，導致機體抗腫瘤免疫功能降低，可能是急性白血病發生發展的重要因素。同時我們還觀察到AML和ALL兩組P-STAT5和FOXP3水平比較無顯著差異，提示AML、ALL發病在信號轉導、轉錄和免疫逃逸機制方面可能具有一定的同質性。

新近研究發現，STAT5在Treg的發育、增殖及轉錄因子FOXP3表達等方面均發揮重要作用，STAT5蛋白的活化對轉錄因子FOXP3的表達與調控起到關鍵作用,其機制可能是多種信號分子以Treg的特異性物質FOXP3為目標，通過STAT蛋白引發FOXP3表達，從而促使了在胸腺和外周Treg的存在[2,14,15]。盡管以往的諸多研究對PSTAT5蛋白和FOXP3的表達及其在白血病致病過程中的作用進行了大量探索，并且得到了較一致的觀察結果，但將兩者結合在白血病患者骨髓細胞上同時檢測并進行相關性分析的報道尚未見到。目前，蛋白磷酸化流式細胞分析技術的應用為揭示病理的信號通路提供了一種可靠的方法[16,17]。隨著磷酸化抗體和特異性單抗的出現，流式細胞術檢測細胞內信號通路磷酸化蛋白技術的發展，可以更好的在蛋白水平對P-STAT5和FOXP3進行單細胞的水平研究，我們的結果顯示，AL患者P-STAT5及FOXP3水平顯著正相關(P<0.05)，初步可以推測兩者可能共同參與了該病的發生過程。

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