小型香豬復方殼多糖組織工程皮膚的構建及組織學特點*

陶 宇，伍津津，吳國選，魯元剛，朱堂友，畢建軍，雷 霞

組織工程是應用生命科學與工程學的原理與技術，在正確認識哺乳動物的正常及病理兩種狀態下的組織結構與功能關系的基礎上，研究開發用以修復、維持、促進人體各種組織或器官損傷后的功能和形態的生物替代物的一門新興學科。組織工程皮膚是組織工程中研究最早、進展最快的領域，在短短的30年發展進程中，已經從開始的表皮片、真皮替代物，發展到具有雙層結構的人工皮膚，較之原先簡單的封閉創面，恢復皮膚缺損區的屏障功能，已經向主動促進創面愈合乃至永久性覆蓋創面方面發展延伸，為解決大面積燒傷及其他臨床救治所需的皮源缺乏提供了治療手段［1］。國外已有多種商品化的皮膚替代物出售并用于基礎研究和臨床治療，如應用于皮膚大面積燒傷、靜脈性潰瘍及大皰性皮膚病等皮膚損毀性疾病的治療［2-4］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 角質形成細胞培養基，主要由Eagle動物細胞培養基（DMEM，Gibco公司）、羥基哌嗪乙磺酸（HEPES，Sigma 公司）、標準胎牛血清（Hyclone公司）、表皮生長因子（EGF，Sigma公司）和胰島素（Novo Nordisk A／s），按比例配制；殼多糖、硫酸軟骨素、透明質酸、彈性蛋白、層黏蛋白（均為Sigma公司）；分離酶（Sigma公司）；胰島素（徐州萬邦生化制藥有限公司）；氫化可的松（中國上海信誼藥廠）；胰蛋白酶（Sigma公司）；表皮細胞生長因子（Sigma公司）；膠原酶（Sigma 公司）

1.1.2 設備 二氧化碳孵箱（TC2323，美國Sheld lab公司）、超凈工作臺（SW-CJ-2F，蘇州安泰空氣技術有限公司）、一次性培養瓶（Sigma），水純化系統（美國 Milli-Q Biocel Millipore Corporation）等。

1.2 方法

1.2.1 角質形成細胞和成纖維細胞制備 取筆者所在科已構建的小型香豬細胞庫中的第3～12代角質形成細胞和成纖維細胞，復蘇后接種于50 ml培養瓶中，37℃孵箱中靜置培養，次日更換培養液，待細胞達90%融合后加入0.25%胰蛋白酶2 ml，室溫下消化2～5 min，光鏡下當細胞變圓、細胞間隙增大時，加入2 mlDMEM終止消化，1000 r／min離心，棄上清，培養液重懸，獲得角質形成細胞（keratinocytes，KC）懸液和纖維細胞（fibroblasts，FB）懸液備用［5，6］。

1.2.2 復方殼多糖組織工程皮膚制備 按筆者已建立的方法進行［7］。即：小型香豬真皮替代物的培養，冰浴條件下依次加入一定量的濃縮Dulbecco改良的Eagle培養基、優質胎牛血清、Ⅰ型膠原、殼多糖、糖胺聚糖等。每一步充分攪拌混勻，用1 mol／L NaOH調整溶液pH 至7．2～7.4，然后加入豬的成纖維細胞懸液2 ml（細胞數約109／L）并混勻。將該混合物吸人110 mm培養皿中。室溫下靜置15 min左右形成凝膠，加入Dulbecco改良的Eagle培養基10 ml。置37℃、體積分數為0．05的CO2孵箱培養。換液1次／2～3 d。制備小型香豬組織工程皮膚：上述制備的人工真皮培養3 d后在其表面加入傳代培養的豬的角質形成細胞懸液2 ml（細胞數約109／L）。改用角質形成細胞培養基（含表皮細胞生長因子10 μg／L、胰島素 0．12 U ／ml、氫化可的松 0．5 g／L、青霉素 100 U／ml、鏈霉素 100 U／ml）培養，換液 1次／2～3 d。培養6 d左右將替代物置于設計好的鋼絲網上做氣-液界面培養。

1.2.3 組織學檢查 在培養15 d時，將復方殼多糖組織工程皮膚用中性甲醛溶液和2.5%戊二醛固定24 h以上，常規脫水、浸蠟、石蠟包埋和切片，蘇木精—伊紅（HE）染色，在顯微鏡下測量表皮部分的厚度。

2 結 果

2．1 角質形成細胞的培養情況 復蘇后的小型香豬角質形成細胞鏡下呈橢圓形或多角形，靜置培養4 h后見細胞貼壁生長，約5 d融合成片，鋪滿整個瓶底，呈“鋪路石樣”。可在體外連續傳代。

2．2 真皮成纖維細胞的培養情況 復蘇后的小型香豬成纖維細胞鏡下呈橢圓形或梭形，培養2 h后即見細胞貼壁生長，呈梭形，約3～5 d基本融合，呈旋渦狀生長。

2.3 豬真皮基質浸沒培養的變化情況 剛制備的真皮基質呈紅色，倒置顯微鏡下凝膠各層面均可見尚未恢復形態的類圓形或不規則形的成纖維細胞，3 h或更長時間恢復梭形，但有分支。以后凝膠中的成纖維細胞逐漸增多，細胞狹長，一般有2個以上分支，排列沒有一定的方向性。3 d后隨著凝膠的收縮，人工真皮逐漸與培養板壁和底分離，漂浮于培養液中，面積縮小，厚度變薄，顏色逐漸變成乳白色，透光度下降，不易見到凝膠中的細胞。真皮基質的收縮發生于第3天，開始并不同步，最大收縮發生于第6～12天，真皮基質的直徑收縮到45%左右。以后收縮減慢，收縮度趨于一致。隨著培養時間的延長，真皮替代物的大小差異變得不明顯。加入角質形成細胞后，真皮基質將加快收縮。

2．4 小型香豬組織工程皮膚的培養情況 在培養第3天的直徑約8 cm的真皮基質上加入傳代后的小型香豬角質形成細胞，其上可見覆蓋了一層菲薄的角質形成細胞層。浸沒培養6 d后置400目篩網上做氣—液界面培養，角質形成細胞層色素日漸加深。至直徑4 cm大小時基本停止收縮。氣液界面培養14 d后的組織工程皮膚有一定的彈性和韌性，有一定的抗拉力和抗擠壓力。

2．5 大體觀察 制備的復方殼多糖組織工程皮膚質地柔韌，富含液體，厚約 1．5～2．0 mm，表面的表皮層呈黑褐色，色澤均勻，與下方的真皮層結合緊密，在移動、剪切及縫合過程中不易發生表皮層剝離。組織工程皮膚有一定的抗張強度，適合臨床操作需要。

2.6 組織學檢查 復方殼多糖組織工程皮膚的光鏡觀察結果，鏡下表、真皮雙層結構清晰可見（圖1）。表皮厚約150 μm，各層結構分化良好，依次分為基底層、棘層和角質層，共有7～12層細胞，最外層的角化表皮細胞呈松散的角蛋白絲，可分離。表皮下方處可見較多的表皮突伸向真皮空間，在真皮區形成圓形或橢圓形結構，類似角化珠。真、表皮連接有起伏，真皮中可見較多呈梭形結構的成纖維細胞，真皮支架結構松散。與正常小型香豬皮膚（圖2）相比，體外構建的組織工程皮膚表皮層較薄，角質形成細胞無角化，可見散在的空泡樣變性細胞，基底細胞較少，上皮角、真皮乳頭層不明顯，真皮網狀層較疏松，無毛細血管、汗腺、皮脂腺等正常皮膚結構。

圖1 復方殼多糖組織工程皮膚顯微鏡下結構觀察

3 討 論

圖2 正常小型香豬皮膚的顯微鏡下結構觀察

皮膚組織工程學是應用組織工程學技術的基本方法，將體外培養的高濃度組織細胞，擴增后吸附于一種生物相容性良好并可被人體逐步吸收的細胞外基質上，進行人工皮膚構建和移植。皮膚的組織結構比較復雜，分為表皮、真皮和皮下組織3部分。此外，還有血管、毛囊、汗腺、皮脂腺等。目前體外培養的具有全部上述結構的組織工程皮膚尚未問世。近年來組織工程皮膚的研究已經取得了許多突破性進展，并已在臨床應用中取得了令人滿意的效果。目前，已有多個組織工程皮膚商品化，如Epicel、A11oDerm、Dermgraft、Apligraf、Pelanac、Integra 等，其中 Apligraf和Dermagraft均已通過嚴格的臨床試驗評價，用于燒傷和其他皮膚缺損性疾病的治療，并獲美國FDA批準試用于臨床［8-10］。

本實驗采用組織工程的方法，在鼠尾膠原中加入殼多糖、糖胺聚糖等天然細胞外基質及傳代培養的貴州小型香豬成纖維細胞及角質形成細胞，成功構建了小型香豬的復合殼多糖組織工程皮膚。與正常小型香豬皮膚相比，體外構建的組織工程皮膚組織學上還存在表皮層較薄，角質形成細胞角化不明顯，基底細胞較少，上皮角、真皮乳頭層不明顯，真皮網狀層較疏松，無毛細血管、汗腺、皮脂腺等缺陷，需要進一步更深入的研究。該種方法培養的人工皮膚屬于雙層活性皮膚替代物，在組織學上表皮、真皮雙層結構清晰；表皮各層結構分化良好，依次分為基底層、棘層和角質層，表明其中的角質形成細胞在培養過程中具有生長、分裂和分化活性。真皮中的成纖維細胞具有代謝活性，不僅使膠原凝膠收縮形成較緊密的網格結構，而且還產生和分泌膠原及其他基質成分至膠原網格中。本實驗成功培養出了小型香豬的活性皮膚替代物，并對具體的培養條件、技術方法、組織學特征進行了分析比較，為組織工程皮膚替代物的制備及臨床應用奠定了基礎。

［1］雷 霞，伍津津，朱堂友，等．復方殼多糖人工皮膚促進創面愈合的作用［J］．中國臨床康復，2001，8（17）：3300-3302.

［2］朱堂友，伍津津，李文維．皮膚創面覆蓋物的研究進展［J］．國外醫學皮膚性病學分冊，2000，26（1）：6-9.

［3］ Falabella AF，Valencia IC，Eaglstein WH，et al．Tissue-engineered skin in the healing of patients with epidermolysis bullosa wounds［J］.Arch Dermatol，2000，136（10）：1225-30.

［4］ Falanga V，Margolis D，Alvarez O，et al．Rapid healing of venous ulcers and lack of clinical rejection with an allogeneic cultured human skin equivalent［J］．Arch Dermatol，1998，134（3）：293-300.

［5］吳國選，伍津津，朱堂友，等.豬復合人工皮膚組織工程學研究：小型香豬角質形成細胞庫的構建［J］．中國臨床康復，2004，8（32）：7142-4.

［6］吳國選，伍津津，朱堂友，等．貴州小型香豬皮膚成纖維細胞庫的構建［J］．中國臨床康復，2004，8（29）：6386-8.

［7］朱堂友，伍津津，胡 浪，等．復合殼多糖皮膚替代物的制備［J］．中華創傷雜志，2002，10（18）：625-626.

［8］ Phillips TJ.New skin for old developments in biological skin substitutes［J］.Arch Dermatol，1998，134（3）：344-349.

［9］ Berthod F，Damour O.In vitro reconstructed skin models for wound coverage in deep burns［J］.Br J Dermatol，1997，136（6）:809-816.

［10］ Spiclvogel RL.A histological study of Dermagraft TC in patients burn wounds［J］.J Burn Care Rehabil，1997，18（1P12）:S16-S21.