板藍根多肽在人工胃腸環(huán)境中的降解研究

劉西京，南 楠，，侯安國

(1.深圳職業(yè)技術學院應用化學與生物技術學院，廣東 深圳 518055;2云南中醫(yī)學院，云南 昆明 650500)

板藍根為十字花科植物菘藍Isatis indigotica Fort.的干燥根，具有清熱解毒、涼血利咽之效［1］。藥理研究證明板藍根具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗內(nèi)毒素、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)等作用［2-3］，臨床上主要用于病毒性疾病及細菌感染性疾病的治療［4］。

關于板藍根清熱解毒的物質(zhì)基礎研究有大量報道，如陳凱等認為總氨基酸和總生物堿是其抗炎的有效部位［5］;何立巍等認為多糖可能為板藍根的活性成分之一［6］;也有學者認為有機酸是板藍根的有效成分［7］;徐麗華等發(fā)現(xiàn)水提物、總生物堿、表告依春有較強的抗病毒作用［8］;也有學者認為，板藍根藥材中的尿苷、鳥苷、腺苷等核苷類成分是其主要活性成分［9］。

盡管研究眾多，但仍缺乏共識。本課題組研究發(fā)現(xiàn)板藍根植物含多肽量較高，又有良好的體內(nèi)外抗病毒效果。本實驗擬模擬胃腸環(huán)境研究板藍根多肽的降解情況，為進一步深入研究板藍根抗病毒活性成分和藥理作用提供實驗基礎。

1 儀器與試劑

1.1 藥品與試劑 板藍根 (產(chǎn)地甘肅);胃蛋白酶、胰蛋白酶、十二烷基磺酸鈉 (SDS)、Bis-Acrylamide、Acrylamide、硫酸銨 (AP)(均為Sigma公司);TEMED(Aldrich公司);SDS-PAGE蛋白標準 (Pharmacia低分子量蛋白標準);4×上樣緩沖液 (Fermentas);考馬斯亮藍 R-250(Amresco分裝);硝酸銀 (成都化學試劑廠);硫酸銨 (岳陽寶慶化工);10 kD超濾離心管 (Millipore);BCA試劑盒(碧云天生物);甲醇、乙腈 (Merck色譜純);乙醇 (天津市化學試劑分析純);磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、碳酸氫鈉、鹽酸、冰乙酸 (均為天津南開化工廠分析純);DNFB(西亞試劑);Tris(Serva公司)。

1.2 儀器 Multiskan MK3全自動酶標儀 (Thermo公司);Agilent 1100高效液相色譜儀;Eclipse XDB C18反相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);DZKW-D-2電熱恒溫水浴鍋(鄭州南北儀器設備有限公司);KY-IA恒溫搖床 (金壇市岸頭良友實驗儀器廠);Avanti J30I大容量冷凍離心機;ALPLTA 1-2冷凍干燥機 (CHRIST公司);Milli-Q超純水機 (Milipore公司);移液器 (Eppendorf公司);小型垂直電泳系統(tǒng) (Bio-Rad公司);170-8170凝膠成像分析儀(Bio-rad公司)。

2 方法與結果

2.1 板藍根總肽的制備 取藥材適量，粉碎過二號篩，加10倍量超純水浸提24 h，10000 r/min離心取上清，加(NH4)2SO4至體積分數(shù)為80%，靜置過夜，5000 r/min離心取沉淀，凍干得板藍根總肽，實驗時加蒸餾水配制成0.25 g/L多肽溶液。

2.2 板藍根多肽在人工胃液或人工腸液中的降解研究 取7支1.5 mL離心管，每管加入人工胃液或人工腸液100 μL，37℃水浴恒溫，然后分別加入多肽溶液 (37℃預溫)100 μL，37 ℃ 消化。分別于 0、1、5、15、30、90、180 min取樣，加入0.168 mol/L Na2CO3適量，調(diào)節(jié)pH使酶解反應終止。離心取上清液，以空白胃腸液作為對照，BCA法檢測蛋白濃度［10］;以SDS-PAGE法檢測板藍根多肽的降解情況。

2.2.1 SDS-PAGE法檢測板藍根多肽降解情況 由圖1可知，板藍根多肽主要相對分子質(zhì)量約為26～100 kD，其中26 kD附近蛋白量最高，34 kD處次之，其他相對分子質(zhì)量的多肽豐度相對較低，不成條帶，36 kD處為胃蛋白酶條帶。經(jīng)人工胃液消化后，0～5 min內(nèi)消化產(chǎn)物電泳圖譜無明顯差別，隨時間延長，26 kD附近條帶明顯變淺，34 kD處無明顯變化，無新條帶產(chǎn)生。

圖1 板藍根多肽經(jīng)人工胃液降解后的SDSPAGE電泳譜圖

經(jīng)人工腸液消化 (見圖2)，24 kD附近的條帶為胰蛋白酶的條帶，隨著時間的變化，34 kD處條帶漸漸變淺，26 kD處條帶無明顯變化。

圖2 板藍根多肽經(jīng)人工腸液降解后的SDSPAGE電泳譜圖

2.2.2 BCA法測定板藍根多肽在人工胃液和人工腸液中的變化 板藍根多肽經(jīng)人工胃液消化后，1 min內(nèi)板藍根多肽量下降，而后顯著上升，在15 min時達到峰值，其后緩慢下降，到90 min后基本穩(wěn)定。經(jīng)人工腸液消化后，1 min內(nèi)板藍根多肽量下降，而后緩慢上升，在45 min達到峰值，其后至180 min緩慢下降。見圖3。

圖3 消化后多肽變化曲線

2.3 HPLC法測定氨基酸 采用2，4-二硝基氟苯 (DNFB)柱前衍生化法測定樣品中游離氨基酸［11］。

2.3.1 樣品制備 精密稱取5 g板藍根粉末，粉碎過二號篩，加10倍量超純水浸提24 h，6000 r/min離心15 min，取上清液。置于蒸發(fā)皿中揮發(fā)至約50 mL，轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，加超純水定容至刻度，搖勻。以“2.2”項法操作，進樣10 μL，即得。

2.3.2 標準曲線 蘇氨酸、脯氨酸、精氨酸、纈氨酸線性方程分別為 A=8262C +45.299、A=4629.3C +1306.1、A=604.02C+255.37、A=8703.5C － 4.3392，線性范圍分別為0.0117～1.17、0.067～6.7、0.2954～29.54、0.0044 ～0.44 μg。

2.3.3 色譜條件 Agilent ODS C18色譜柱 (5 μm，250 mm×4.6 mm);流動相A為0.014 mol/L磷酸鹽緩沖液 (用磷酸二氫鈉調(diào)pH 8.2)，流動相B為乙腈水溶液 (V乙腈∶V水=1∶1)，梯度洗脫 (0～20 min，20% ～80%B);體積流量1 mL/min;柱溫30℃。檢測波長為360 nm(0～8.2 min)，398 nm(8.2～10.0 min)，360 nm(10～20 min);進樣量10 μL;步長4 nm。結果見表1。

表1 板藍根多肽消化前后氨基酸變化情況

由結果可知，除了經(jīng)人工腸液消化降解后，精氨酸的量有一定程度的增加外，其他游離氨基酸無明顯變化。

3 討論

3.1 根據(jù)實驗結果可知，板藍根多肽主要集中在相對分子質(zhì)量約為26～100 kD之間，尤其是以26 kD和34 kD附近為主。經(jīng)人工胃液消化后，隨著時間的推移，26 kD附近條帶明顯變淺，34 kD附近條帶基本無明顯變化。與此相反，經(jīng)人工腸液消化后，隨著時間的推移，34 kD附近條帶明顯變淺，26 kD附近條帶基本無明顯變化，說明經(jīng)過胃腸液作用后，板藍根多肽被降解破壞。

為了測定的準確性，故選板藍根中主要的蘇氨酸、脯氨酸、精氨酸和纈氨酸進行測定。HPLC測定結果表明，經(jīng)過人工胃腸液消化后，除精氨酸的量有少量增加外，其余氨基酸無明顯變化;BCA法測定結果表明，經(jīng)消化后胃腸液中仍有大量多肽。

以上結果綜合可知，經(jīng)過人工胃腸液消化后，板藍根多肽有了降解變化，但氨基酸的變化不明顯，說明板藍根多肽降解成了小分子多肽，而沒有進一步分解成游離氨基酸，BCA法測定結果也證實了這一結果。

3.2 最初測定總肽消化前后氨基酸的變化情況時，由于氨基酸含有量極低，不容易測定，因此，用水提液進行消化測定，提高了測定的準確度。

3.3 傳統(tǒng)認為蛋白或高分子多肽只有被水解為氨基酸后才能被人體或動物吸收，后來發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)在消化道的降解產(chǎn)物大部分是小分子多肽，他們以完整形式被吸收進入循環(huán)系統(tǒng)而被組織利用，與游離氨基酸相比，小肽吸收具有吸收快、耗能低、吸收率高等優(yōu)勢。對于板藍根的物質(zhì)基礎到底為何眾多學者進行了有益的探索，本課題組研究板藍根的水提醇沉液時，經(jīng)陽離子樹脂后氨洗得到多肽部分，占水提醇沉后固體量一半左右。經(jīng)過初步藥理實驗表明板藍根多肽具有一定抗流感病毒的作用，認為板藍根有效部位為多肽，與報道［12］相符。本實驗結果也證明，板藍根多肽在體內(nèi)主要降解成小分子肽被吸收，在《中國藥典》2010年版中，把氨基酸作為定性鑒別也值得商榷。由于多肽活性的多樣性，有必要對植物多肽研究引起足夠的重視，而不是傳統(tǒng)的當做雜質(zhì)而除去。

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