LC-MS法測(cè)定川楝子中川楝素

羅文匯，畢曉黎，孫冬梅

(廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣東廣州 510095)

川楝子為楝科植物川楝Melia toosendan Sieb.et Zucc.的干燥成熟果實(shí)。味苦，性寒;有小毒。具疏肝泄熱、行氣止痛、殺蟲(chóng)的功效，用于肝郁化火、胸脅、脘腹、疝氣疼痛、蟲(chóng)積腹痛，被收載于《中國(guó)藥典》2010年版一部［1］。

目前，對(duì)川楝子中三萜類(lèi)研究較多的是川楝素，川楝素具有驅(qū)蟲(chóng)、抗癌、抗菌、影響神經(jīng)肌肉及細(xì)胞、影響呼吸中樞及消炎等多種生物活性［2-3］，目前文獻(xiàn)報(bào)道多采用HPLC-UV方法對(duì)川楝子藥材及其制劑中的川楝素進(jìn)行測(cè)定［4-12］。本實(shí)驗(yàn)擬用LC-MS法對(duì)川楝子藥材中川楝素進(jìn)行測(cè)定，所建立的方法簡(jiǎn)便，快速，靈敏，為控制川楝子藥材的質(zhì)量，提供了一個(gè)良好基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

Accela高效液相色譜儀、TSQ Quantum Access Max三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)器 (美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司);Advantage A10超純水處理系統(tǒng) (美國(guó)Millipore公司);乙腈、甲醇、甲酸為色譜純 (Merck公司);高純氮?dú)?(純度＞99.999%)、高線氬氣 (純度＞99.999%);水為超純水;川楝子 (批號(hào)分別為YL110204、YL110309、Y120314、YL120519、TP1206003、TP120825)由廣東一方制藥有限公司提供，經(jīng)本院劉法錦研究員鑒別為《中國(guó)藥典》2010年版一部收載品種;川楝素對(duì)照品 (批號(hào)111842-201001)購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Hypersil GOLD C18色譜柱 (50 mm×2.1 mm，3 μm);柱溫30℃;流動(dòng)相乙腈-0.01%甲酸 (31∶69);體積流量0.2 mL/min;進(jìn)樣量2 μL。

2.2 質(zhì)譜條件 高溫電噴霧離子源 (HESI源);負(fù)離子選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè) (SRM);噴霧電壓3.5 kV;噴霧溫度350℃;毛細(xì)管溫度300℃;鞘氣壓力35 psi(1 psi=6.895 kPa);輔助氣體積流量1.5 L/min;用于定量分析的離子為m/z 573(12v)。

2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取川楝素對(duì)照品12.36 mg，加甲醇溶解，定容至100 mL量瓶?jī)?nèi)，搖勻，得123.6 μg/mL的對(duì)照品貯備液，置4℃冰箱中保存，使用時(shí)用甲醇稀釋至所需質(zhì)量濃度。

2.4 供試品溶液的制備［1］取本品粉末約0.25 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，加熱回流1 h，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，再用孔徑為0.22 μm的濾膜過(guò)濾，即得。

2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取不同體積的川楝素對(duì)照品溶液分別置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成1.24、3.71、6.18、9.89、12.36 μg/mL系列溶液，分別取2 μL，注入LC-MS聯(lián)用儀，以川楝素的兩個(gè)峰面積之和 (Y)對(duì)質(zhì)量濃度 (X)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y=3750X+32400，r=0.9949。川楝素在 (1.24～12.36 μg/mL)范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn) 選取3.71 μg/mL的川楝素對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量2 μL，按照“2.1”項(xiàng)和“2.2”項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行測(cè)定，記錄質(zhì)譜峰面積，結(jié)果川楝素兩個(gè)峰面積之和RSD為2.50%(n=6)，表明精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取川楝子樣品0.25 g，按照“2.4”項(xiàng)試驗(yàn)方法進(jìn)行制備供試品溶液，“2.1”項(xiàng)和“2.2”項(xiàng)試驗(yàn)條件進(jìn)行測(cè)定，分別于0、1、2、4、8、12、24 h測(cè)定，記錄質(zhì)譜峰面積，考察穩(wěn)定性。結(jié)果川楝素兩個(gè)峰面積之和的RSD為2.19%，樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 分別稱(chēng)取6份川楝子樣品各0.25 g，按照“2.4”項(xiàng)試驗(yàn)方法進(jìn)行制備供試品溶液，“2.1”項(xiàng)和“2.2”項(xiàng)試驗(yàn)條件進(jìn)行測(cè)定，記錄質(zhì)譜峰面積，測(cè)得川楝子供試品中川楝素兩個(gè)峰面積之和的RSD為2.38%。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知量的同一批川楝子供試品9份各0.125 g，分別精密加入一定量的川楝素對(duì)照品溶液，按照“2.4”項(xiàng)供試品溶液制備方法進(jìn)行操作，“2.1”項(xiàng)和“2.2”項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得川楝子供試品平均加樣回收率為97.96%，RSD為3.01%，見(jiàn)表1。

表1 川楝素回收率測(cè)定結(jié)果

2.10 樣品測(cè)定 取川楝子供試品各6份，按照“2.4”項(xiàng)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行操作，“2.1”項(xiàng)和“2.2”項(xiàng)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行測(cè)定，按外標(biāo)法以川楝素兩個(gè)峰面積之和定量，代入線性回歸方程，計(jì)算川楝子中川楝素。結(jié)果川楝子供試品中川楝素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 (0.734±0.037)mg/g，RSD為2.05%。見(jiàn)圖1～2。

圖1 川楝素對(duì)照品TIC圖譜

圖2 川楝子藥材TIC圖譜

3 討論

川楝素的毒性作用之一為肌無(wú)力，但在去神經(jīng)骨骼肌上，川楝素則能增強(qiáng)直接刺激引起的收縮反應(yīng)［13］。由于川楝子的廣泛生理活性和臨床應(yīng)用，其存在的急性和慢性的毒性作用不應(yīng)忽視，對(duì)川楝素量需要控制。川楝素結(jié)構(gòu)中具有半縮醛，始終有兩個(gè)互變異構(gòu)體存在［14-15］，故定量時(shí)以川楝素兩個(gè)峰面積之和計(jì)算。本實(shí)驗(yàn)采用液質(zhì)聯(lián)用的方法測(cè)定川楝子中川楝素的量，方法靈敏、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，為川楝子的質(zhì)量控制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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