精制胃樂膠囊促進大鼠乙酸性胃潰瘍修復的作用與機制

王雨波 ，余麗梅，姚觀平，陳文明，吳 芹

(1.遵義醫學院附屬醫院貴州省細胞工程重點實驗室，貴州遵義 563002;2.遵義醫學院第三附屬醫院藥劑科，貴州遵義 563002;3.遵義醫學院貴州省基礎藥理重點實驗室貴州遵義 563003)

目前胃潰瘍的治療策略主要包括減小胃黏膜損害性因素的作用，同時采用抗幽門螺旋桿菌感染藥物和促進黏膜修復藥物進行治療［1-2］。

胃樂散由白芍、蒼術、元胡、肉桂等六味中藥組成，民間用于治療胃脘痛，胃炎、十二指腸潰瘍等病癥治療。藥理學研究表明，胃樂散對多種實驗性胃潰瘍具有較好的治療作用，并可抑制胃酸分泌，促進胃黏膜修復和調節免疫功能［3-5］，組方中藥的多種活性成分還具有舒張血管、抗炎、鎮痛、調節胃腸運動等作用［6-7］。精制胃樂膠囊是以胃樂散原方，采用現代藥物制劑工藝精制而成。本實驗主要研究精制胃樂膠囊對乙酸性胃潰瘍的治療作用，并分析可能涉及的胃潰瘍修復機制，為該藥的臨床試驗研究提供重要的臨床前基礎研究資料。

1 材料

1.1 動物 SD大鼠，雌雄各半，體質量180～220 g，第三軍醫大學實驗動物中心提供，清潔級 (Ⅱ級)，合格證號:SCXK(遼)2007-0005。

1.2 藥品和試劑 精制胃樂膠囊按胃樂散原方精制，由貴州省遵義醫學院藥理教研室與貴陽春科藥物研發股份有限公司聯合研制、提供。雷尼替丁為四川省通園制藥有限公司生產，批號090501(國藥準字H51022156)。6-酮-前列腺素 (6-Keto-PGF 1α)試劑盒由解放軍總院生物工程研究所提供，批號 20100521;兔抗大鼠表皮生長因子 (epidermal growth factor，EGF)抗體由武漢博士德有限公司提供，批號 20100225;SP-9000免疫組化染色試劑盒由北京中衫金橋有限公司提供，批號 20100303;100%冰乙酸為沈陽化學試劑廠提供，批號20080703。

1.3 儀器 3K30型高速冷凍離心機 (德國Sigma公司)，Leica光學顯微鏡 (德國Leica Microsystems公司);GC-2010-γ放射免疫計數器 (科大創新股份有限公司中加公司)。

2 方法

2.1 乙酸性胃潰瘍模型制備［8-9］SD大鼠48只，禁食、不禁水24 h，隨機分出8只作正常對照組，另40只大鼠，乙醚麻醉剖腹，暴露胃體，用內徑6 mm，長2 cm的玻璃管固定于胃體漿膜面，并于管內注入0.1 mL乙酸，1 min后即用棉簽沾去乙酸，生理鹽水棉球清洗，將胃還納于腹腔內，逐層縫合腹壁。胃潰瘍模型大鼠隨機分為5組:模型組、雷尼替丁 (30 mg/kg)、精制胃樂膠囊低、中、高各劑量組 (75，150，300 mg/kg)。造模后第2天開始灌胃給藥，每天9點、17點各給藥1次，正常對照組給予等體積蒸餾水。

2.2 取血和病理組織學檢查 連續給藥12 d后，禁食24 h處死大鼠，腹主動脈取抗凝血4～6 mL，3500 r/min，離心10 min，留取上清液，－20℃保存待用。剖腹取胃，沿潰瘍瘢痕平行于胃長軸方向的最長徑為中心，切取含潰瘍邊緣3 mm左右的胃組織 (約1.0 cm×1.2 cm)，置于4%多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察胃壁組織變化情況。石蠟切片，經脫蠟、水化、抗原修復后，兔抗大鼠EGF抗體 (比例1∶50)和羊抗兔IgG孵育，DAB溶液顯色，蘇木素復染，觀察EGF蛋白表達情況，胃黏膜組織中細胞膜或細胞漿出現棕黃色顆粒為EGF陽性表達細胞。

2.3 潰瘍面積和潰瘍指數 (ulcer index，UI)［10］將胃黏膜展平開，用游標卡尺測量潰瘍的最大長徑和垂直的最大寬徑，以兩者的乘積作為UI，并計算潰瘍抑制率，潰瘍抑制率 (%)=(模型組 UI－給藥組 UI)/模型組UI×100%。

2.4 6-Keto-PGF 1α測定 取留存的血漿，按照6-Keto-PGF 1α試劑盒說明書進行操作，采用放免法，用GC-2010-γ放射免疫計數器進行測定，計算血漿6-Keto-PGF 1α的量。

3 統計學處理

4 結果

4.1 精制胃樂膠囊對潰瘍指數的影響 與模型組比較，低、中、高劑量精制胃樂膠囊和雷尼替丁治療12 d后，均能明顯降低乙酸性胃潰瘍大鼠的胃潰瘍面積和UI(P＜0.05和P＜0.01)，潰瘍抑制率可達31.33% ～50.38%(見表1)。

表1 精制胃樂膠囊對乙酸性胃潰瘍大鼠潰瘍指數的影響(n=8，)

表1 精制胃樂膠囊對乙酸性胃潰瘍大鼠潰瘍指數的影響(n=8，)

注:與模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 劑量/(mg·kg－1) 潰瘍指數/mm2 潰瘍抑制率/%模型 等量蒸餾水 3.99±0.91—雷尼替丁 30 2.06±1.27＊＊ 48.37精制胃樂膠囊 75 2.74±1.30* 31.33150 1.98 ±0.60＊＊ 50.38300 2.40 ±1.06＊＊39.85

4.2 胃組織大體標本觀察 肉眼可見模型組大鼠潰瘍部位的胃漿膜面多有大網膜包裹，部分胃漿膜面與大網膜及周圍肝臟等組織一定程度黏連，胃潰瘍面較深，表面粗糙，潰瘍周圍胃壁有明顯皺縮和缺損;精制胃樂膠囊組和雷尼替丁組胃漿膜也有大網膜包裹，但周圍組織黏連較少，胃潰瘍面積明顯縮小，潰瘍損傷處表面較為光滑，尤其是精制胃樂膠囊中、高劑量組和雷尼替丁組新生的黏膜基本與周圍正常黏膜面長平，胃黏膜表面與正常對照組十分接近(見圖1)。

圖1 乙酸性潰瘍大鼠胃大體解剖標本 (箭頭所示為潰瘍或乙酸涂抹位置)

4.3 大鼠胃黏膜的病理組織學變化 病理切片鏡下觀察:模型組潰瘍明顯，各層細胞均排列紊亂，黏膜層較薄，部分區域黏膜缺損，黏膜下層可見大量炎性細胞浸潤，表面炎性滲出、壞死，較多缺損直達肌層，黏膜損傷修復不明顯。各劑量精制胃樂膠囊組和雷尼替丁組潰瘍已不明顯或潰瘍明顯變淺，各層細胞排列有序，黏膜層較厚，炎性細胞明顯較少，黏膜損傷修復明顯 (見圖2)。

圖2 精制胃樂膠囊對乙酸性胃潰瘍大鼠胃黏膜病理組織學變化的影響 (HE，×50)

4.4 精制胃樂膠囊對大鼠胃黏膜上皮細胞EGF表達的影響 免疫組化染色結果如圖3所示，胃黏膜層 EGF主要表達于腺上皮細胞，模型組黏膜層盡管有大量表達EGF的陽性細胞，但總體著色較淺，為弱陽性表達;雷尼替丁組和中、高劑量精制胃樂膠囊組黏膜層不但有大量表達EGF的陽性細胞，且著色明顯較深，EGF陽性表達為強陽性，顯示精制胃樂膠囊可提高潰瘍愈合時胃黏膜EGF的蛋白表達水平。

圖3 精制胃樂膠囊對乙酸性潰瘍大鼠胃黏膜組織EGF蛋白表達的影響 (×50，免疫組織化學染色)

4.5 精制胃樂膠囊對乙酸性胃潰瘍大鼠血漿6-Keto-PGF 1α量的影響 放免法測定結果顯示，與模型組比較，精制胃樂膠囊實驗組血漿中6-Keto-PGF 1α水平僅有增加趨勢，但無明顯差異 (P﹥0.05，見表2)。

表2 精制胃樂膠囊對乙酸性胃潰瘍大鼠血漿6-Keto-PGF 1α水平的影響 (n=5，)

表2 精制胃樂膠囊對乙酸性胃潰瘍大鼠血漿6-Keto-PGF 1α水平的影響 (n=5，)

組別 劑量/(mg·kg－1)6-Keto-PGF 1α/(pg·mL－1)模型 等量蒸餾水329.72±111.28雷尼替丁 30 439.88±150.38精制胃樂膠囊 75 553.40±322.94150 464.09±198.59300 435.85±164.67

5 討論

乙酸性潰瘍主要是由于乙酸損傷局部組織，破壞胃黏膜、黏液-碳酸氫鹽屏障等防御因素，引起微循環受損所致，其相當于人類慢性胃潰瘍，在潰瘍外形、組織學、愈合和復發過程上均類似人類胃潰瘍，是較為常用的胃潰瘍模型。精制胃樂膠囊治療12 d后，給予精制胃樂膠囊能顯著降低乙酸性潰瘍大鼠的UI，各劑量組潰瘍面減少、變淺，炎細胞少，修復明顯，表明精制胃樂膠囊對乙酸性胃潰瘍具有明顯治療作用，也提示精制胃樂膠囊可能在促進潰瘍修復方面也具有重要作用，進而我們進一步測定了血漿6-Keto-PGF 1α的量和乙酸性胃潰瘍組織EGF的表達情況。

前列腺素E(prostaglandin，PG)等是公認的胃黏膜防御修復因子，PG在人類合成的主要是PGE2，在大鼠則為PGI2，由于PGI2生物半衰期僅2～3 min，很快變成穩定的6-Keto-PGF 1α，故測6-Keto-PGF 1α的量能反映血漿PGI2的水平［11］。本實驗大鼠血漿中6-Keto-PGF 1α量與模型組比較僅有增加趨勢，但無明顯差異，提示精制胃樂膠囊對血漿中6-Keto-PGF 1α量沒有影響，精制胃樂膠囊可能不影響PG水平。

EGF是一種具有抑制胃酸分泌、促進上皮細胞增殖，組織修復和細胞保護作用的內源性物質，在保護胃黏膜免受損傷因子破壞、維持胃黏膜完整性起到非常重要的作用［12］，精制胃樂膠囊各組胃黏膜中EGF表達較模型組強，表明精制胃樂膠囊可能通過EGF表達增加，而促進上皮增殖、維護組織修復和細胞保護，也提示EGF表達的增加可能是精制胃樂膠囊治療胃潰瘍的重要機制之一。

綜上所述，精制胃樂膠囊對乙酸型胃潰瘍具有顯著治療作用，可降低潰瘍指數，增強胃黏膜組織 EGF的表達，促進胃潰瘍損傷黏膜的修復，顯示出精制胃樂膠囊在治療胃潰瘍方面，具有多靶點綜合作用的優勢，值得深入研究。

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