HPLC梯度洗脫法同時(shí)測(cè)定克痛酊中的去氫二異丁香酚、五味子甲素、α-香附酮和木犀草素

何曉梅

(西北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州 730030)

克痛酊為中藥復(fù)方制劑，處方來(lái)源于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十五冊(cè)，由黑老虎根、香附、廣藿香、豆豉姜、香加皮、花椒、九里香、雞骨香、石菖蒲、高良姜、莪術(shù)、三棱、細(xì)辛、兩面針、雙眼龍、降香、黃芩、梔子、樟腦、薄荷腦二十味藥物組成。具有祛風(fēng)去濕、活血止痛之功效，可用于肚痛、跌打腫痛、風(fēng)濕骨痛等癥的治療［1-2］。原部頒標(biāo)準(zhǔn)中未對(duì)方中的任何成分進(jìn)行定量測(cè)定，不能有效地控制產(chǎn)品的質(zhì)量和療效，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相梯度洗脫法對(duì)黑老虎根［3］中去氫二異丁香酚、五味子甲素和香附中α-香附酮、木犀草素進(jìn)行定量測(cè)定方法研究，為完善該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 試藥與儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀;G1322A脫氣機(jī)、G1311A四元泵、G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器、Chemstation色譜工作站;G1315B可變波長(zhǎng)檢測(cè)器;五味子甲素對(duì)照品 (批號(hào)為110764-201111，純度以99.5%計(jì))、α-香附酮對(duì)照品 (批號(hào)為110748-201111，純度以99.3%計(jì))、去氫二異丁香酚對(duì)照品 (批號(hào)為111838-201102，純度以99.4%計(jì))和木犀草素對(duì)照品 (批號(hào)為111520-200504，用前置五氧化二磷干燥器減壓干燥12 h)來(lái)源于中國(guó)食品藥品檢定研究院;藥材均購(gòu)于甘肅省民安中藥飲片有限公司，各藥材按國(guó)家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下檢驗(yàn)均符合要求;克痛酊 (每瓶裝15 mL，批號(hào)為131010、131016、131027)購(gòu)于廣東一力羅定制藥有限公司;磷酸 (分析純，廣州化學(xué)試劑二廠);甲醇 (色譜純，天津市康科德科技有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 依利特Hypersil C18色譜柱(4.6 mm ×200 mm，5 μm);體積 流量 0.9 mL/min;流動(dòng)相A為甲醇，流動(dòng)相B為0.2%磷酸溶液［4-5］，梯度洗脫 (0～11 min，75.0%A;12～26 min，75.0% →60.0%A;27～50 min，60.0%A);檢測(cè)波長(zhǎng) (0～26min，λ1=254 nm［6-7］;27 ～ 36 min，λ2=270 nm;37 ～ 50 min，λ3=350 nm［8-11］);體積流量 0.9 mL/min。此系統(tǒng)條件下所測(cè)組分與其他組分分離效果良好，理論塔板數(shù)按五味子甲素、α-香附酮、去氫二異丁香酚和木犀草素計(jì)均不低于2000，分離度均大于2。

原題：The 2011 MW9.0Tohoku earthquake：Comparison of GPS and strong－motion data

2.2 樣品制備

我國(guó)公路建設(shè)項(xiàng)目引發(fā)的水土流失主要為：破壞原有生態(tài)環(huán)境，擾動(dòng)和破壞地表。據(jù)統(tǒng)計(jì)，“十二五”期間，公路建設(shè)直接或間接破壞地表總面積為119.6萬(wàn)公頃。由于公路建設(shè)所經(jīng)區(qū)域的地貌類型復(fù)雜多樣，因此公路工程建設(shè)過(guò)程中不同地貌類型的水土流失程度也不盡相同。

2.2.3 陰性對(duì)照試驗(yàn) 按克痛酊處方比例稱取除黑老虎根的其余藥味和除香附的其余藥味各一份，按克痛酊的生產(chǎn)工藝分別制成缺黑老虎根的陰性樣品和缺香附的陰性樣品，按照上述供試品溶液的配制方法制成缺黑老虎根的陰性對(duì)照溶液和缺香附的陰性對(duì)照溶液。分別精密吸取10 μL供試品溶液、混合對(duì)照品溶液、缺黑老虎根的陰性對(duì)照溶液及缺香附的陰性對(duì)照溶液，按上述方法測(cè)定，結(jié)果在與五味子甲素、α-香附酮、去氫二異丁香酚和木犀草素對(duì)照品色譜圖相應(yīng)的保留時(shí)間處，供試品溶液色譜圖中有吸收峰，而陰性對(duì)照色譜圖中未顯吸收峰，色譜圖見圖1。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一批樣品6份，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算，求得各組分RSD分別為0.8%(五味子甲素)、0.4%(α-香附酮)、0.5%(去氫二異丁香酚)和0.6%(木犀草素)。結(jié)果表明，本法測(cè)定重復(fù)性良好。

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 取五味子甲素、α-香附酮、去氫二異丁香酚和木犀草素對(duì)照品各適量，精密稱定，分別加80%甲醇制成混合對(duì)照品溶液 (五味子甲素為0.0106 mg/mL，α-香附酮為0.0074 mg/mL，去氫二異丁香酚為 0.0218 mg/mL，木犀草素為0.0032 mg/mL)。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定，記錄五味子甲素、α-香附酮、去氫二異丁香酚和木犀草素的峰面積，RSD分別為0.4%(五味子甲素)、0.3%(α-香附酮)、0.8%(去氫二異丁香酚)和0.6%(木犀草素)。結(jié)果表明，儀器具有良好精密度。

黏土的作用比較復(fù)雜，它表現(xiàn)在以下4個(gè)方面：陽(yáng)離子交換量高產(chǎn)生附加導(dǎo)電性使電阻率降低［2］；伊利石和蒙脫石本身具有很強(qiáng)的吸水性，使束縛水飽和度增加，電阻率降低；黏土的填隙式和襯膜式分布造成微孔隙發(fā)育使束縛水飽和度增大，電阻率降低［3］；泥質(zhì)含量增加也可導(dǎo)致電阻率降低。

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、5.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，用80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別精密吸取上述溶液和對(duì)照品溶液各20 μL，注入色譜儀中，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積Y與進(jìn)樣量X進(jìn)行線性回歸處理，得回歸方程為:五味子甲素Y=2.0342×106X －265.3，r=0.9995;α-香附酮 Y=1.1362×106X+289.5，r=0.9997;去氫二異丁香酚Y=2.5702×106X+533.1，r=0.9994;木犀草素 Y=1.1689×106X－433.8，r=0.9996。五味子甲素、α-香附酮、去氫二異丁香酚和木犀草素分別在 0.0106～0.2120、0.0074～0.1480、0.0218～0.4360、0.0032～0.0640 μg范圍內(nèi)進(jìn)樣量與峰面積線性關(guān)系良好。

寶玉爹如此一說(shuō)，倒把喜姑的臉說(shuō)紅了。她略帶嬌嗔地說(shuō)，人家這不是想向你老人家拜師學(xué)藝嘛！接著又說(shuō)，我聽人說(shuō)，你演《黃鶴樓》里的劉備，臉上可以表演一邊笑，一邊驚慌，是真的嗎？

在高額利潤(rùn)下，銀行業(yè)員工的收入水平也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他行業(yè)工作人員 。據(jù)公開數(shù)據(jù)顯示，多數(shù)上市銀行員工2012年上半年人均收入都在10萬(wàn)元以上，居各行業(yè)之首。在中國(guó)的實(shí)體經(jīng)濟(jì)發(fā)展遭遇困難的情況下，這樣的差距自然引發(fā)人們普遍質(zhì)疑。而銀行與公眾是一場(chǎng)有輸有贏的“零和游戲”。當(dāng)然，在這場(chǎng)“零和游戲”中，銀行肯定是贏家，而且贏得很大，而公眾永遠(yuǎn)是輸家，而且輸?shù)貌幻鞑话祝@勢(shì)必會(huì)導(dǎo)致公眾的不滿。

2.2.2 供試品溶液的配制 精密量取本品10 mL，置50 mL具塞錐形瓶中，加80%甲醇稀釋至刻度，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液，在室溫下放置0、1、2、4、6、8 h后，每次進(jìn)樣10 μL，測(cè)定其峰面積值，求得各組分RSD分別為0.6%(五味子甲素)、0.8%(α-香附酮)、0.3%(去氫二異丁香酚)和0.7%(木犀草素)。結(jié)果表明，供試品溶液8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知含有量的同一批克痛酊 (批號(hào) 131010，五味子甲素為0.054 mg/mL，α-香附酮為0.036 mg/mL，去氫二異丁香酚為0.112 mg/mL，木犀草素為 0.018 mg/mL)5 mL，置50 mL具塞錐形瓶中，分別精密加入混合對(duì)照品溶液25 mL、用80%甲醇稀釋至刻度，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的配制方法制備加樣供試品試液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各組分回收率，結(jié)果見表1。

2.4 樣品測(cè)定 取3個(gè)批號(hào)的樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品制備方法，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 取五味子甲素、α-香附酮、去氫二異丁香酚和木犀草素對(duì)照品各適量，分別加80%甲醇溶解制成每1 mL含0.02 mg的溶液，在200～400 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行紫外掃描，結(jié)果五味子甲素和α-香附酮對(duì)照品溶液均在254 nm處有最大吸收，去氫二異丁香酚對(duì)照品溶液在270 nm處有最大吸收，木犀草素對(duì)照品溶液在350 nm處有最大吸收。故選擇254 nm作為五味子甲素和α-香附酮的測(cè)定波長(zhǎng)，270 nm作為去氫二異丁香酚的測(cè)定波長(zhǎng)，350 nm作為木犀草素的測(cè)定波長(zhǎng)。

表1 五味子甲素、α-香附酮、去氫二異丁香酚和木犀草素回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of recovery test for deoxyschizandrin，αcyperone，dehydrodiisoeugenol and luteolin

表2 樣品測(cè)定結(jié)果 (，n=3)Tab.2 Results of content determination(，n=3)

表2 樣品測(cè)定結(jié)果 (，n=3)Tab.2 Results of content determination(，n=3)

批 號(hào) 五味子甲素/(mg·mL －1)α-香附酮/(mg·mL －1)去氫二異丁香酚/(mg·mL －1)木犀草素/(mg·mL －1)1310100.054±0.0010.036±0.0010.112±0.0020.018±0.0011310160.060±0.0010.040±0.0010.122±0.0020.021±0.0011310270.056±0.0010.033±0.0010.109±0.0020.019±0.001

3.2 流動(dòng)相的選擇 本實(shí)驗(yàn)中曾分別采用乙腈-水［10］、甲醇-0.4% 磷酸［4-5，12］和甲醇-0.2% 磷酸溶液為流動(dòng)相不同比例進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果以乙腈-水不同比例梯度洗脫時(shí)五味子甲素峰型良好，但其他3個(gè)組分達(dá)不到基線分離;以甲醇-0.4%磷酸不同比例梯度洗脫時(shí)木犀草素、五味子甲素和去氫二異丁香酚均能達(dá)到基線分離，而α-香附酮峰型較差，有拖尾現(xiàn)象;以甲醇-0.2%磷酸溶液為流動(dòng)相不同比例進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，所測(cè)各組分分離效果良好，分離度均大于2。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑:第十五冊(cè)［S］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1998:89.

［2］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:2010年版一部［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:241-242，附錄30，附錄36.

［3］王 楠，李占林，劉曉秋，等.黑老虎根化學(xué)成分的研究(Ⅱ)［J］.中國(guó)藥物化學(xué)雜志，2012，22(4):305-309.

［4］袁春玲，王佩琪，郭偉英.HPLC法同時(shí)測(cè)定婦可靖膠囊中木犀草素和芍藥苷的含量［J］.中國(guó)藥房，2012，23(3):263-265.

［5］王國(guó)英，薛培鳳，布 仁，等.HPLC法測(cè)定蒙藥藍(lán)盆花中木犀草素和芹菜素的含量［J］.中國(guó)藥房，2012，23(15):1407-1409.

［6］呂 霞，茍瓊心，李陳波，等.HPLC法測(cè)定七制香附丸中 α-香附酮的含量［J］.中國(guó)藥房，2011，22(16):1507-1508.

［7］李 姣，常增榮，傅欣彤.璇機(jī)化積膏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.中成藥，2012，34(8):1615-1618.

［8］王艷艷，張 杰，侯依珊，等.忍冬葉中木犀草素及木犀草苷含量的動(dòng)態(tài)變化［J］.中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2013，44(6):568-570.

［9］吳金爽，吳德玲，俞年軍，等.RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定亳菊總黃酮中3種黃酮類成分［J］.中成藥，2013，35(4):774-776.

［10］黃曉文，王李平，范華均，等.開奶茶顆粒劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的試驗(yàn)研究［J］.中成藥，2012，34(10):1933-1938.

［11］張林林，王永吉，李 航，等.UFLC法同時(shí)測(cè)定護(hù)肝膠囊中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素［J］.中成藥，2013，35(1):96-99.

［12］常 秋，蔣華軍，羅敏燕，等.不同地區(qū)香薷各部位總黃酮及游離黃酮的分析研究［J］.中成藥，2013，35(3):580-584.