梔子環烯醚萜苷鼻用原位凝膠的制備

楊軍宣，張海燕，周年化，幸 忠，趙成城

(1.重慶醫科大學中醫藥學院，重慶 400016;2.江西中醫藥大學現代中藥制劑教育部重點實驗室，江西南昌 330004;3.重慶希爾安藥業有限公司，重慶 401121)

梔子為茜草科植物梔子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果實，具有瀉火除煩，涼血、止血、清熱解毒、清利濕熱等功效［1］。梔子的主要有效成分為環烯醚萜苷類成分，現代研究表明，梔子及其有效成分在消化系統、心腦血管系統、中樞神經系統等方面具有廣泛作用，可用于腦血管疾病的防治［2-3］。由于鼻黏膜在解剖生理上與腦存在獨特的天然聯系，鼻腔給藥是近年來腦部疾病防治研究最多的給藥途徑之一，不僅具有藥物吸收迅速，無肝首過效應，給藥方便等優點，而且還具有向腦內遞藥 (腦靶向)的特性［4-5］。本實驗對梔子環烯醚萜苷鼻用原位凝膠的制備工藝及制劑的物理性質進行研究，以期為其新制劑的研究開發提供參考和依據。

1 材料

OSMOMAT030型滲透壓計 (德國高能泰克公司);Franz擴散池 (青島榮升必達公司);TT-6D藥物透皮擴散試驗儀 (天津市正通科技有限公司);HF6A型多頭磁力加熱攪拌器 (常州國華電器有限公司);DM-BA400數碼光學顯微鏡 (MOTIC公司);HBDV-Ⅱ型旋轉黏度計 (美國BROOKFIELD公司);BP211D電子天平 (德國sartorius);超聲清洗器 (上海必能信超聲有限公司);RE-53C型旋轉蒸發器 (上海亞榮生化儀器廠);DZF-6050電熱恒溫真空干燥箱 (嘉興市中新醫療儀器有限公司);超濾離心管 (美國Miliipore公司);TGL-16G型高速離心機 (上海安亭科學儀器有限公司);PHS-3C型精密PH計 (上海虹益儀器儀表有限公司)。

去乙酰結冷膠 (上海眾偉生化有限公司);三羥甲基氨基甲烷 (上海新興化工試劑研究所);甘露醇 (北京鳳禮精求商貿有限責任公司);葡萄糖(重慶大新藥業股份有限公司);尼泊金甲酯/乙酯(天津市大茂化學試劑廠);酚紅染料 (上海邁瑞爾化學技術有限公司);梔子環烯醚萜苷提取物(自制，總苷含有量50%以上);人工鼻液［自制，離子強度Na+(150±32)mmol/L，K+(41±18)mmol/L，Ca2+(8±4)mmol/L］;其他試劑均為分析純;水為重蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 原位凝膠的制備

2.1.1 輔料種類與用量的考察 本實驗制備離子敏感型原位凝膠。離子敏感型原位凝膠目前最常用基質為結冷膠 (gellan gum)［6］，它是美國Kelco公司開發的新型藥用輔料，其中去乙酰結冷膠(DGG)為一線性多糖，當溶液中有一價或二價陽離子存在時能與聚合物鏈上的羰基絡合，形成穩定的雙螺旋鏈間氫鍵，每兩條雙螺旋鏈逆向聚集，構成三維凝膠網絡，包裹藥物，形成半固體凝膠態。本實驗選擇去乙酰結冷膠 (DGG)作為基質，對其用量進行研究。

取一定量的結冷膠，加入適量水，90℃加熱使溶解，分別配制成 0.1%、0.2%、0.3%、0.5%、0.7%、1.0%的溶液。分別觀察操作難易程度、外觀性狀等;另取凝膠溶液1 mL，加入適量人工鼻液，觀察溶液-凝膠相變離子濃度及時間、黏度變化等指標，結果見表1～3及圖1。

表1 輔料用量的考察Tab.1 Results of excipients amount

表1表明，基質用量越大，操作越困難，溶解時間越長。

表2 相變離子濃度及相變時間測定Tab.2 Results of ion concentration and phase change time

表2表明，基質用量越大，消耗離子溶液越少，相變時間越短，0.1%基質溶液在測定時間內不發生相變。表明輔料的用量必須達到0.2%及以上。

表3 黏度測定結果Tab.3 Results of viscosity determination

圖1 凝膠劑黏度變化曲線Fig.1 Viscosity curve of in situ gel

表3、圖1表明，基質用量0.1%無明顯的黏度“突躍”過程，溶液沒有發生明顯的相轉變;基質用量0.2%及以上有一個明顯的黏度“突躍”過程，發生相轉變，且黏度越大，相轉變所需要的離子溶液體積 (人工鼻液)越少。基質用量0.2%時發生相轉變的離子溶液體積為8 mL，相當于人工鼻液離子強度的1/6時即發生相轉變。

綜上所述，結冷膠用量為0.2%即可，既可減少輔料的用量，又保證在生理離子濃度下發生相轉變。

2.1.2 pH調節劑的考察 由于鼻腔給藥制劑直接作用于鼻黏膜表面，必須考慮pH值及黏膜刺激性問題。為避免刺激鼻黏膜，鼻用制劑的pH一般為5～9之間即可［7］。通過測定，梔子環烯醚萜苷水溶液的pH值為6.1左右，不需加入pH調節劑。或可選用30%三羥甲基氨基甲烷調節pH至近中性即可［8］。測定原位凝膠劑的pH為6.2，逐步滴加30%三羥甲基氨基甲烷溶液調節pH，邊加邊攪拌。當pH為7.0左右時，消耗30%三羥甲基氨基甲烷溶液的體積約為1%(V/V)，此即為pH調節劑的用量。

2.1.3 滲透壓調節劑的考察 正常人體血漿滲透壓值為0.28～0.32 OSmol/kg，選用常用的滲透壓調節劑葡萄糖或甘露醇進行研究。結果見表4。

表4 滲透壓調節劑的考察結果Tab.4 Results of osmotic pressure determination

表4表明，滲透壓調節劑選用葡萄糖，用量為3%即可。

2.1.4 防腐劑的選擇 鼻用制劑可加入適量防腐劑，考慮到本噴霧劑為水溶液制劑，為保證質量的穩定性，需加入一定的防腐劑。預試表明，苯甲酸鈉、苯甲醇等防腐劑可能影響制劑穩定性。選用制藥及食品工業中廣泛應用的防腐劑尼泊金甲酯或乙酯可以滿足要求，用量為常規用量0.2%即可。

綜上所述，梔子環烯醚萜苷原位凝膠的制備工藝為:取藥物8 g，加0.2 g的去乙酰結冷膠，加100 mL水加熱使溶解，然后加入1%(V/V)30%三羥甲基氨基甲烷溶液和3 g葡萄糖及0.2 g的防腐劑，溶解，即得。

2.2 原位凝膠物理性質考察 根據離子敏感型原位凝膠的質量要求［9］，對梔子環烯醚萜苷原位凝膠的以下物理性質進行考察。

2.2.1 原位凝膠的微觀結構 參考文獻 ［10］，分別取不同原位凝膠一滴于載玻片上，在其中心位置分別滴加一滴含有酚紅染料的人工鼻液，使其充分反應后覆上蓋玻片，放入37℃恒溫鼓風干燥箱內，待水分揮干后冷卻至室溫，光學顯微鏡下觀察原位凝膠的微觀結構。結果見圖2。

圖2 原位凝膠微觀結構圖Fig.2 Microscopic structure diagrams of in situ gel(variant matrix%)

圖2A表明DGG溶液在滴加去離子水后仍為一線性聚合物，而圖2B、C、D明顯看到DGG與人工鼻黏液反應后其微觀結構由棒狀小微管相互聯結而形成凝膠網絡，并且隨著DGG質量濃度的增加這種凝膠結構更加致密。

2.2.2 原位凝膠的外排水量測定 參考文獻，采用離心失水試驗［10-11］。取不同原位凝膠，以1∶1與人工鼻液反應，靜置2 min使其反應完全，小心轉移至超濾離心管內管中，注意避免破壞凝膠表面，稱重 (記重M0)，以200 r/min離心，于不同時間點取出內管分別稱重 (記重M)，以下列公式計算原位凝膠在外力作用下持水能力，繪制持水能力隨時間的變化曲線。試驗結果見表5和圖3。

表5 不同質量分數DGG溶液形成凝膠后持水力測定結果(n=3，)Tab.5 Results of water holding capacity of DGG subjected to centrifugation(n=3，)

表5 不同質量分數DGG溶液形成凝膠后持水力測定結果(n=3，)Tab.5 Results of water holding capacity of DGG subjected to centrifugation(n=3，)

時間/min0.1%原位凝膠/%0.2%原位凝膠/%0.5%原位凝膠/%0100 100 1005 72.43±3.54 80.11±4.66 89.19±2.6710 50.10±2.18 71.80±7.32 78.81±4.4715 41.25±4.51 64.37±5.35 72.35±5.1020 29.39±3.23 58.98±4.36 65.43±3.4325 28.66±2.18 55.38±5.20 63.36±3.6230 26.33±2.67 53.64±4.43 60.05±4.02

圖3 不同質量分數DGG溶液形成凝膠后持水力隨離心時間的變化曲線Fig.3 Water holding capacity of DGG subjected to centrifugation

隨著DGG質量分數的增加，形成凝膠后的持水能力也隨之增加，在外力的作用下，水分可從凝膠中緩慢釋放出來。起始質量分數較低的DGG溶液形成的凝膠持水性相對較差，凝膠結構易被破壞。

2.2.3 原位凝膠的黏附力測定 根據黏附力測定原理，自制黏附力測定簡易裝置，見圖4，以原位凝膠與鼻黏膜斷裂時單位面積的質量 (mg/cm2)為指標，能直觀評價凝膠與黏膜的黏附力，且試驗操作簡單易行，穩定可靠。

圖4 黏附力測定裝置Fig.4 Device for adhesive force determination

取動物鼻黏膜，按圖4所示將黏膜的漿膜面固定于砝碼表面和試驗平臺上 (砝碼半徑r/cm，必要時用細線纏繞固定，計重M1/g)，在試驗平臺的黏膜上均勻涂布原位凝膠100 μL，再滴加100 μL人工鼻液，充分反應2 min，然后將砝碼置試驗平臺上使上層黏膜與凝膠密切接觸1 min，隨后在平衡桿 (測定之前預平衡至M1/g)另一端掛上一定質量的砝碼 (光電天平環碼)，直至分開，記錄總質量M2/g。按下列公式計算凝膠與黏膜的黏附力(mg/cm2)。試驗結果見表6。

表6 黏附力測定結果 (n=3，)Tab.6 Results of adhesive force determination(n=3，)

表6 黏附力測定結果 (n=3，)Tab.6 Results of adhesive force determination(n=3，)

凝膠劑黏附力(mg/cm2)組別 0.1%凝膠劑 0.2%凝膠劑 0.5%24.48±3.05 72.72±7.67 100.32±5.43

結果表明，輔料用量0.2%的黏附力相當于0.1%的3倍。

2.2.4 原位凝膠相變臨界陽離子濃度測定 參考文獻 ［12］，在Franz擴散池接受室內加入原位凝膠1 mL和電磁攪拌子，置于 (32±0.5)℃，200 r/min的恒溫恒速透皮擴散試驗儀中，平衡20 min后用定量加液器加入人工鼻黏液，記錄使電磁攪拌子完全停止轉動所需體積，計算原位凝膠的相變臨界陽離子濃度。

在含結冷膠0.1%的原位凝膠1 mL中，剛開始加入人工鼻黏液時電磁攪拌子轉動受阻，隨著人工鼻液的加入，電磁攪拌子不會停止轉動，反而隨著人工鼻液的增加轉速加快，可能是未發生完全相變，反而被人工鼻液稀釋;含結冷膠0.2%和0.5%的原位凝膠加入人工鼻黏液時電磁攪拌子轉動均受阻，且受阻程度隨體積增加而加大，當加入人工鼻黏液0.6 mL時，0.2%原位凝膠的電磁攪拌子完全停止轉動。當加入人工鼻黏液0.4 mL時，0.5%的原位凝膠的電磁攪拌子完全停止轉動。人工鼻黏液的離子強度為Na+(150±32)mmol/L，K+(41±18)mmol/L，Ca2+(8±4)mmol/L［13］，結果表明，梔子環烯醚萜苷原位凝膠在陽離子濃度為人工鼻黏液的1/2時即發生相變。

3 討論

原位凝膠主要有溫度敏感型、pH敏感型和離子敏感型三種類型［14］。離子敏感型原位凝膠與溫度或pH敏感型原位凝膠相比明顯的優勢為:(1)輔料用量低 (0.5%以下);(2)鼻黏膜和纖毛毒性小;(3)無須冷藏，使用方便。同時其制備工藝簡便，制劑穩定［8］。離子敏感型原位凝膠目前最常用基質為結冷膠 (gellan gum)，它是美國Kelco公司開發的新型藥用輔料，其中去乙酰結冷膠(DGG)為一線性多糖，當溶液中有一價或二價陽離子存在時能與聚合物鏈上的羰基絡合，形成穩定的雙螺旋鏈間氫鍵，每兩條雙螺旋鏈逆向聚集，構成三維凝膠網絡，包裹藥物，形成半固體凝膠態。所以本實驗選擇去乙酰結冷膠 (DGG)作為基質制備離子敏感型原位凝膠。

研究結果表明，梔子環烯醚萜苷原位凝膠在陽離子濃度為人工鼻黏液的1/2時即發生相轉變;原位凝膠與人工鼻黏液反應后形成凝膠網絡，包裹藥物;原位凝膠黏附力較好，能有效黏附于鼻黏膜，延長藥物在鼻腔的滯留時間，增強吸收，提高生物利用度;同時原位凝膠持水性較好，凝膠結構不易被破壞，制劑較穩定。本實驗研究為梔子環烯醚萜苷新制劑的進一步研究開發提供了參考。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:231.

［2］楊軍宣，張海燕，趙成城，等.梔子環烯醚萜苷治療腦缺血損傷的作用機理研究進展［J］.中國實驗方劑學，2010，16(6):325-329.

［3］盧金鳳，向 靚，黃 薇，等.梔子總環烯醚萜苷對腦出血大鼠內皮屏障的影響［J］.中藥藥理與臨床，2012，28(3):48-51.

［4］蔣新國.藥物的鼻黏膜膜吸收［J］.中國新藥雜志，2003，12(11):902-905.

［5］許潤春.黃芩苷磷脂復合物經鼻給藥腦內遞藥特性的研究［D］.成都:成都中醫藥大學，2008:24.

［6］羅潔琦，沙先誼，方曉玲.三七總皂苷離子敏感型鼻用原位凝膠的制備［J］.中草藥，2011，42(7):1299-1304.

［7］陶 濤，趙 雁，岳 鵬，等.組成石杉堿甲鼻用原位凝膠噴霧劑的藥物組合物、其制備方法及用途:中國，200510110162.1 ［P］.2011-11-30.

［8］陶 濤，趙 雁，岳 鵬，等.石杉堿甲鼻用原位凝膠的制備及其經鼻腦靶向性評價［J］.藥學學報，2006，41(11):1104-1110.

［9］萬美霞.離子敏感型鼻用原位凝膠質量評價研究進展［J］.瀘州醫學院學報，2013，36(2):195-197.

［10］曹師磊，徐 豐，蔣新國，等.離子敏感鼻用原位凝膠的制備及其兔消除動力學［J］.中國藥學雜志，2007，42(11):844-849.

［11］欒 琳，甘 勇，張馨欣，等.利巴韋林溫度-離子敏感型鼻用原位凝膠噴霧劑的制備及體外性質考察［J］.沈陽藥科大學學報，2009，26(4):249-253.

［12］關玲玲，張開蓮.嗎氯貝胺離子敏感型鼻用原位凝膠的制備及其體外釋放度考察［J］.中國醫院藥學雜志，2012，32(11):864-867.

［13］Kubo W，Miyazaki S，Attwood D.Oral sustained delivery of paracetamol from in situ gelling gellan and sodium alginate formulations［J］.Int J Pharm，2003，258(122):55-64.

［14］陶 濤，岳 鵬，趙 雁，等.石杉堿甲鼻用原位凝膠噴霧劑的制備及穩定性研究［J］.中國新藥雜志，2006，15(22):1950-1955.