大鼠腦缺血再灌注損傷后萵苣苷B對皮質Grp78和Caspase-3 mRNA表達的影響

牛秉軒，司艷莉，詹合琴*，閆福林

(1.新鄉醫學院藥學院，河南新鄉 453003;2.新鄉醫學院基礎醫學院，河南新鄉 453003)

缺血性腦血管疾病是臨床上的多發病和常見病，目前臨床對于缺血性腦血管疾病的治療主要是通過溶栓療法來恢復腦血流灌注，但再灌注會引起更大的損傷。高翅果菊Pterocypsela elata，菊科翅果菊屬植物，中國大陸很多省份均有分布，其中萵苣芮 B(lactuside B，3β-葡萄糖-14-羥基-11β，13-二氫木香烯內酯)是本類植物中的主要化學成分之一。本研究小組前期從高翅果菊中提取到的萵苣苷B具有明顯的抗腦缺血作用［1-2］，但國內外對其作用機制研究相對較少。以往報道顯示，腦缺血再灌注損傷與Grp78(glucose regulated protein，葡萄糖調節蛋白78)和Caspase-3的激活有關，上調Grp78 mRNA和下調Caspase-3 mRNA的表達水平能有效地保護神經元，那么萵苣苷B對腦缺血再灌注損傷的保護作用是否與Grp78 mRNA和Caspase-3 mRNA的表達有關是本研究擬探討的問題。

1 材料與方法

1.1 材料 Eppendorf AG PCR擴增儀 (德國Eppendorf公司);DYY-7C型水平電泳儀 (北京市六一儀器廠);TGL-16G-A臺式高速低溫離心機 (上海安亭科學儀器廠);UV-2102PC紫外分光光度計(尤尼柯上海儀器有限公司);SANYO MDFU4086S超低溫冰箱 (日本 SANYO公司);TOCAN240凝膠成像系統 (上海領成生物科技有限公司);萵苣苷B由藥物化學教研室閆福林教授提供，為白色粉末狀 (純度＞99.9%);陽性對照藥尼莫地平注射液 (山東方明藥業股份有限公司，4 mg/20 mL，20 mL/支);DL2000DNA Marker(北京天根生化有限公司);Trizol(美國Invertrogen公司);loading buffer和RT-PCR試劑盒 (寶生物工程大連有限公司，TaKaRa Code:DRR014A)。

1.2 動物實驗 1)選用清潔級SD(Sprague-Dawiey)雄性大鼠 (鄭州大學醫學院實驗動物中心，體質量260～300 g，動物合格證號 SYXK(豫)2005-0012)。2)大鼠腹腔注射 (大鼠腹腔注射量為0.5～1 mL/100 g)［3］，按0.5 mL/100 g計算，稱取300 mg萵苣苷B溶入30 mL蒸餾水中，配成萵苣苷B高劑量組所用藥液 (50 mg/kg)，再抽取高劑量組液體10 mL對倍稀釋配成中劑量組所用藥液20 mL(25 mg/kg);最后再抽取中劑量組液體10 mL對倍稀釋配成低劑量組所用藥液(12.5 mg/kg)。3)隨機分為6組，即假手術組、模型組、陽性對照組 (1 mg/kg)、萵苣苷B低劑量組 (12.5 mg/kg)、萵苣苷 B中劑量組 (25 mg/kg)、萵苣苷B高劑量組 (50 mg/kg)，8只/組。4)制備大腦中動脈缺血再灌注損傷模型。選用1.5號漁線 (DaDong Yang生產)制備阻塞線，每根剪成5～6 cm長，將其一端用火燒成圓形，在1%的肝素溶液中浸泡備用。10%的水合氯醛麻醉動物后，參照Longa［4］線栓法制備大鼠大腦中動脈缺血再灌注損傷模型，每組動物于再灌后按5 mL/kg腹腔注射給藥，2次/d。分別于缺血再灌注24 h和72 h后處死動物，收取標本進行實驗。

1.3 RNA提取 1)提取組織在液氮中研磨，每100 mg組織加1 mL Trizol進行勻漿處理。2)在裂解液中每1 mL Trizol加入0.2 mL三氯甲烷，劇烈震蕩幾秒后室溫放置10 min。3)5℃下12000×g離心20 min，取上清，每1 mL Trizol加入0.5 mL異丙醇，混勻后室溫下放置10 min。4)5℃下12000×g離心10 min，去上清，每1 mL Trizol加入1 mL 75%乙醇洗滌RNA沉淀，25℃干燥約5 min，溶于適量無RNase的水;紫外分光光度法測定RNA的濃度與純度，－70℃保存。

1.4 RT-PCR法檢測Grp78、Caspase-3基因的轉錄水平 cDNA模板用TaKaRa pimeScript TM RT-PCR試劑盒合成，并進行擴增。PCR反應條件為:95℃ 5 min;95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環;72℃ 10 min，引物見表1。PCR反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳。采用Quantity One圖像分析系統分析各個條帶的灰度值，以擴增后的特異性目的片段灰度值與同時擴增的β-actin片段灰度值相比，其比值作為特異性擴增目的片段的半定量檢測值。每組每只動物重復3次求其平均值。

表1 Grp78、Caspase-3和β-actin的上、下游引物Tab.1 Upstream and downstream primers sequence of Grp78，Caspase-3 and β-actin

2 結果

2.1 萵苣苷B對大鼠腦缺血再灌注損傷后不同時間點皮質Grp78 mRNA的影響 結果如表2和圖1所示:模型組動物皮質的Grp78 mRNA表達增多，與假手術組比較有顯著性差異 (P＜0.01);用藥后萵苣苷B各劑量組動物皮質的Grp78 mRNA表達明顯增多，與模型組和陽性對照藥組比較均有顯著性差異 (P＜0.05，P＜0.01)，中劑量組作用較其他劑量組好;用萵苣苷B 72 h后Grp78 mRNA在皮質的表達低于用藥24 h(P＜0.01)。

表2 萵苣苷B對大鼠腦缺血再灌注損傷后皮質Grp78 mRNA的影響 (，n=8)Tab.2 Effects of lactuside B on Grp78 mRNA for cerebral cortex after brain ischemia injury in rats(x ± s，n=8)

表2 萵苣苷B對大鼠腦缺血再灌注損傷后皮質Grp78 mRNA的影響 (，n=8)Tab.2 Effects of lactuside B on Grp78 mRNA for cerebral cortex after brain ischemia injury in rats(x ± s，n=8)

注:模型組與假手術組比較，*P＜0.01;用藥組與模型組比較，#P＜0.01;再灌72 h與24 h之間的比較，◇P＜0.01;萵苣苷B各劑量組與陽性對照藥比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

72 h分組 劑量/(mg·kg －1)缺血再灌損傷24 h缺血再灌損傷假手術組0.16±0.01 0.15±0.00模型組 － 0.33±0.02* 0.18±0.01*陽性對照組 1 0.60±0.02# 0.44±0.02#◇低劑量組 12.5 0.73 ±0.02#ΔΔ 0.54 ±0.02#Δ◇中劑量組 25 1.10 ±0.02#ΔΔ 0.61 ±0.02#ΔΔ◇高劑量組 50 0.63±0.00# 0.30±0.02#ΔΔ◇－

2.2 萵苣苷B對大鼠腦缺血再灌注損傷后不同時間點皮質Caspase-3 mRNA的影響 結果如表3和圖2所示:模型組動物皮質的Caspase-3 mRNA表達增多，與假手術組比較有顯著性差異 (P＜0.01);用藥后萵苣苷B各劑量組動物皮質的Caspase-3 mRNA表達明顯減少，與模型組和陽性對照藥比較均有顯著性差異 (P＜0.05，P＜0.01)，但低劑量組的作用不如中高劑量組;用萵苣苷B 72 h后Caspase-3 mRNA在皮質的表達低于用藥24 h(P＜0.01)。

3 討論

腦缺血再灌注損傷是臨床上導致腦細胞凋亡的常見原因。細胞凋亡是基因嚴格調控而發生的自主性細胞有序死亡，研究發現細胞凋亡主要和內質網應激、線粒體凋亡途徑和膜死亡受體通路等有關。

圖1 萵苣苷B對大鼠腦缺血再灌注損傷后皮質Grp78 mRNA的影響 (，n=8)Fig.1 Effects of lactuside B on Grp78 mRNA for cerebral cortex after brain ischemia reperfusion injury in rats(，n=8)

表3 萵苣苷B對大鼠腦缺血損傷后皮質Caspase-3 mRNA的影響 (，n=8)Tab.3 Effects of lactuside B on caspase-3 mRNA for cerebral cortex after brain ischemia injury in rats(，n=8)

表3 萵苣苷B對大鼠腦缺血損傷后皮質Caspase-3 mRNA的影響 (，n=8)Tab.3 Effects of lactuside B on caspase-3 mRNA for cerebral cortex after brain ischemia injury in rats(，n=8)

注:模型組與假手術組比較，*P＜0.01;用藥組與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01;萵苣苷B各劑量組與陽性對照藥比較，△P＜0.05，△△P＜0.01;再灌72 h與24 h之間的比較，◇P＜0.01

72 h假手術組分組 劑量/(mg·kg －1)缺血再灌損傷24 h缺血再灌損傷－ 0.17±0.01 0.18±0.00模型組 － 0.53±0.02* 0.56±0.02*陽性對照組 1 0.46±0.02 0.30±0.01##◇低劑量組 12.5 0.42±0.01# 0.29±0.01##◇中劑量組 25 0.39±0.02##Δ 0.23±0.01##ΔΔ◇高劑量組 50 0.32±0.02##ΔΔ 0.20±0.02##ΔΔ◇

葡萄糖調節蛋白78(glucose regulated protein，Grp78)是熱休克蛋白70(Hsp70)的成員之一［5］，也是內質網的伴侶蛋白，它對內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)有著重要的緩解作用，Grp78可與內質網中的未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白結合，從而恢復蛋白質的正確構象，維持細胞的內環境穩定［6］。有報道，腦缺血后內質網應激的經典標志物Grp78會大量的表達［7-8］。腦缺血損傷時，腦組織中的鈣失衡、缺氧和自由基增多等因素可誘發內質網功能障礙，產生內質網應激，激活未折疊蛋白反應，未折疊蛋白反應可使Grp78大量表達［9-10］。Grp78在腦缺血再灌注損傷后腦組織中的大量表達，不僅提示出缺血再灌注損傷可激活神經細胞內質網的應激狀態，也提示了Grp78可能在應激狀態下對受到損害的神經細胞起著積極的保護作用。

圖2 萵苣苷B對腦缺血再灌注損傷大腦皮質Caspase-3 mRNA的影響 (，n=8)Fig.2 Effects of lactuside B on Caspase-3 mRNA for cerebral cortex after brain ischemia reperfusion injury in rats(，n=8)

本實驗研究發現，在對大鼠腦部行缺血再灌注術24 h后，模型組大鼠腦皮質的Grp78 mRNA表達均成上升趨勢，但隨著時間的進一步的延長，表達逐漸減少，在再灌損傷72 h時Grp78 mRNA的表達均出現明顯的下降。正常神經細胞內Grp78與Caspase-7，12等蛋白形成大分子復合物，在缺血損傷時，神經細胞內質網發生改變觸發應激反應，該反應激活一系列的生化反應，Grp78因此從復合物中分離出來，游離量的增加使得膜蛋白激酶IRE1和PERK的活性增強，這些酶的活性增強對細胞內質網的穩定起到了一定的保護作用［11］。但過長時間或是過大強度的應激反應反而使得內質網穩定性減弱，Grp78的表達量減少，激活細胞內質網凋亡通路，導致神經細胞死亡，缺血損傷癥狀加重。換言之應激反應的過度表達可引起相關蛋白Grp78的表達減少。

研究結果顯示，給實驗動物腹腔注射萵苣苷B 24 h和72 h后，大鼠皮質的Grp78 mRNA表達均增加，中劑量組在24 h和72 h時間點的作用均明顯超過了陽性對照藥組 (P＜0.01)，低、中、高劑量組在72 h的作用超過陽性對照藥組 (P＜0.05)，因此用藥72 h的作用優于24 h且中劑量組優于其他劑量組。但是萵苣苷B各劑量組對皮質Grp78 mRNA表達的作用效果并非完全一致，不同劑量所產生的作用效果也不相同，該單體化合物的中、低劑量對大鼠皮質抗腦缺血作用較好。實驗結果提示出腦缺血損傷后Grp78 mRNA在動物腦組織的高水平表達只能維持很短時間，不易對受損的神經細胞起到長時間的保護作用，而給予單體化合物萵苣苷B后，大鼠腦部不同部位的Grp78 mRNA表達均有延時性的增加，從而起到抗腦缺血損傷作用。以往研究顯示，Grp78在腦缺血損傷后的腦組織中表達增多，但同種動物如新生鼠和成年鼠的鼠齡差異或在腦內研究部位的差異其達峰時間有較大的不一致性［12-13］。一般情況下，Grp78在腦缺血損傷12 h后達到高峰，此后逐漸下降［14］，本實驗結果與其報道的基本一致。可見，短時的Grp78高表達能夠增強內質網的保護作用，但這種保護作用十分有限，隨著腦缺血損傷時間的延長，損傷程度加劇，Grp78表達降低，由此產生的保護作用減弱。本實驗中，萵苣苷B可以使Grp78在腦缺血損傷后的皮質中增加表達，且能維持一定的時間，提示了萵苣苷B能夠在一定時間內保持腦組織中Grp78的表達處在一個較高的水平，這種持續性的高表達能夠調整腦缺血損傷后神經細胞的內質網功能，產生保護作用。

近年來的研究發現，參與細胞凋亡的多種通路中的線粒體細胞色素C通路是其中的一條重要通路，而Caspase-3蛋白在該通路中起到樞紐的作用，是神經細胞缺血損傷發展過程中的一個關鍵蛋白［6，15］。對于缺血再灌注引起的刺激，神經細胞產生應激反應，這些反應通過信號系統傳遞給細胞內線粒體，引起細胞色素C的釋放，細胞色素C與胞漿中的Apaf-1相互作用，又使得Caspase-9前體活化。多種影響因子的活化以及相互作用，激活了Caspase-3蛋白，最終引起了能夠使細胞死亡的級聯反應。

本研究結果顯示，腦缺血再灌注損傷后，模型組動物皮質的Caspase-3 mRNA表達均增加，說明損傷引發了Caspases級聯反應，細胞凋亡增加。動物腹腔注射萵苣苷B 24 h和72 h后，大鼠皮質的Caspase-3 mRNA表達均降低，各劑量組作用超過了陽性對照藥，尤其以中、高劑量組作用較好，且用藥72 h的作用優于24 h。萵苣苷B各劑量組作用的差異性可能是由于藥物劑量設置不夠適當所致。萵苣苷B可以抑制腦缺血再灌注引起的Caspase-3 mRNA的表達降低。進一步可以說明萵苣苷B通過抑制腦缺血再灌注損傷引起的腦細胞線粒體凋亡途徑來發揮大腦保護作用。

腦缺血再灌注損傷后，大腦皮質細胞死亡不僅影響患者的神經功能，甚至還能威脅患者的生命。以往的研究表明，小鼠和人類細胞死亡過程中內質網應激和線粒體凋亡有協同作用［16-17］，Rizzuto等［18］報道內質網與線粒體之間存在很多緊密聯系，內質網InsP3/Ca2+通道的開放影響線粒體鈣離子的平衡，InsP3/Ca2+通道又是Caspase-3的作用靶標之一。在大腦缺血再灌注損傷中，內質網過度應激也可能涉及與線粒體及細胞色素C的協同作用，從而引發Caspases級聯反應和細胞凋亡。萵苣苷B對腦缺血損傷后不同時間點皮質Grp78 mRNA和Caspase-3 mRNA表達改變的結果，進一步說明萵苣苷B可以抑制腦缺血-再灌注引起的內質網應激以及線粒體凋亡。這對于將萵苣苷B作為一種抗腦缺血再灌注損傷的臨床治療藥物進行研發有著理論支持和積極意義。

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