人MDM2基因真核表達載體的構建及其與p53的相互作用

葉晨陽，徐建明，林莉，王巖，葛飛嬌，趙傳華，李珊珊，付亞莉，李志強

軍事醫學科學院 附屬醫院消化腫瘤科，北京 100071

人MDM2（murine double minute 2）基因定位于12號染色體，廣泛表達于人體的多個器官，在骨骼肌中的含量最高，其次為肝、肺、胰等，與細胞基本生理活動有關。MDM2蛋白包含5個保守區，從N端開始，分別為Ⅰ區（19～102氨基酸殘基，是MDM2與p53相互結合部位）、Ⅱ區（181～185殘基，為核定位序列）、Ⅲ區（221～272殘基，是含有40%谷氨酸和精氨酸殘基的高度酸性區域，能與核糖體L5蛋白及5S rRNA結合）、Ⅳ區（305～322殘基，含有1個鋅指結構）和Ⅴ區（438～478殘基，含有1個環指結構，可介導蛋白質-蛋白質的相互作用，也可以與DNA或RNA結合）[1]。MDM2具有泛素化連接酶的功能，已報道的MDM2蛋白最重要的功能是與p53蛋白直接結合形成p53-MDM2復合物，介導p53通過泛素-蛋白酶體途徑降解，從而抑制p53的功能[2-4]。MDM2在細胞中的其他功能研究相對較少。

我們擬構建MDM2真核表達載體，并驗證其與p53的相互作用，為進一步研究MDM2蛋白在細胞內的功能提供基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

人胚腎293T細胞購自ATCC；pcDNA3.0-Flag載體購自Invitrogen公司；VigoFect為威格拉斯生物技術有限公司產品；限制性內切酶、DNA連接酶、PCR試劑購自TaKaRa公司；DMEM、小牛血清購自Gibco公司；質粒提取、膠回收、PCR回收試劑盒購自Pro?mega公司；測序由華大生物技術有限責任公司完成。

1.2 Flag-MDM2重組質粒的構建與測序

以人乳腺文庫為模板，PCR擴增MDM2基因的CDS序列。正向引物為5'-CGCGGATCCATGGTGA GGAGCAGGCAAATGTG-3'，反向引物為5'-CGG AATTCCTAGGGGAAATAAGTTAGCACAAT-3'。擴增條件：95℃預變性5 min，以95℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸1.5 min行30個循環，72℃延長7 min。用膠回收試劑盒回收PCR產物。用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切pcDNA3.0-Flag載體，經瓊脂糖凝膠電泳后，膠回收載體大片段；將PCR片段回收后再用BamHⅠ和EcoRⅠ酶切，形成帶有粘性末端的雙鏈，用T4DNA連接酶連接入pcDNA3.0-Flag載體，轉化大腸桿菌DH5α，挑選克隆，振蕩培養后提質粒，用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定，鑒定正確的克隆進行測序。

1.3 哺乳動物細胞轉染和Western印跡檢測

將293T細胞接種于6 cm皿中，接種量以轉染時細胞密度達到80%為宜，24 h后進行轉染。將4 μL VigoFect與 200 μL NaCl混合，再將總量為 5 μg的重組質粒與200 μL NaCl混合，然后將上述2種溶液輕輕混合，室溫放置15 min，加入6 cm皿中，24 h后收集細胞蛋白，加入2×SDS加樣緩沖液，煮沸10 min，12 000 r/min離心5min，取上清液進行SDS-PAGE后，轉移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉于4℃封閉1 h，加入用5%脫脂奶粉以1∶5000稀釋的用HRP標記的Flag抗體，室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，用化學發光法顯色5 min，壓片顯影。

1.4 免疫共沉淀

轉染24 h后收集細胞，用0.5 mL IP緩沖液裂解細胞，冰浴30 min；超聲波破碎，4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清，留30 μL做Input；取一定量的偶聯抗體的磁珠，用IP緩沖液平衡3次，每次10 min；取30 μL磁珠加到細胞裂解物中，4℃結合4 h；用0.5 mL IP緩沖液洗滌沉淀物4次，每次10 min；沉淀加入30 μL 2×SDS蛋白加樣緩沖液，煮沸10 min變性，進行SDS-PAGE；用抗另一種蛋白的抗體進行Western印跡分析，檢測2種蛋白質之間是否存在相互作用。

2 結果

2.1 Flag-MDM2重組質粒的構建與鑒定

以人乳腺文庫為模板，PCR擴增人MDM2的編碼序列，獲得長1494 bp的DNA片段，與預期大小一致（圖1）。將PCR產物用BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切后與同樣經這2種酶切的pcDNA3.0-Flag載體連接，轉化大腸桿菌DH5α，挑選克隆，進行菌液PCR鑒定，所得的陽性克隆提質粒經酶切鑒定，可切出2條長度分別約為5000和1494 bp的條帶，5000 bp條帶為pcDNA3.0-Flag載體，1494 bp條帶為MDM2，符合預期結果（圖2）。序列測定結果表明，插入載體的DNA序列與人MDM2基因的編碼序列完全一致（序列略）。

2.2 Flag-MDM2在293T細胞中的表達

將構建的Flag-MDM2重組質粒和空載體分別轉染293T細胞，24 h后收細胞，提取蛋白進行SDSPAGE，Western印跡檢測構建的Flag-MDM2是否表達。結果顯示，轉染Flag-MDM2的細胞裂解物能在相對分子質量約60×103處檢測到明顯的特異性條帶，而轉染空載體的細胞裂解物無條帶（圖3），說明Flag-MDM2重組蛋白在293T細胞中能夠成功表達。

2.3 Flag-MDM2與p53存在相互作用

文獻報道MDM2能夠結合并降解p53，因此，我們利用免疫共沉淀實驗驗證了構建的帶Flag標簽的MDM2與帶Myc標簽的p53的相互作用，結果如圖4，在細胞內p53可以和MDM2結合，而不能與陰性對照Flag空載體結合，說明MDM2與p53存在特異的相互作用，與文獻報道一致。

圖1 PCR擴增人MDM2的編碼序列

圖2 Flag-MDM2的BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切電泳圖譜

圖3 Western印跡檢測Flag-MDM2的表達

圖4 Flag-MDM2與p53存在相互作用

3 討論

我們擴增了人MDM2基因，并連接到帶有Flag標簽的真核表達載體上，經過酶切和測序鑒定克隆構建成功，轉染293T細胞證明Flag-MDM2基因成功表達。根據文獻報道，利用免疫共沉淀實驗驗證了Flag-MDM2與p53的相互作用，證明Flag-MDM2載體表達的蛋白具有生物學功能。

MDM2蛋白由497個氨基酸殘基構成，在膠質母細胞瘤[5]、脂肪肉瘤[6]、黑色素瘤[7]、乳腺癌[8]、食道癌[9]、骨肉瘤[10]、結直腸癌[11-12]等多種腫瘤中過量表達。研究表明，MDM2在腫瘤中發揮癌基因的功能，MDM2的轉基因小鼠實驗證實MDM2會誘導小鼠腫瘤的發生[13-14]。p53是目前研究最深入的抑癌基因，廣泛參與細胞凋亡、細胞周期、基因組穩定性等腫瘤發生發展的關鍵步驟。MDM2癌基因功能的發揮主要是通過泛素-蛋白酶體途徑降解抑癌基因p53，抑制p53的轉錄活性[15]。MDM2在腫瘤中的其他功能及分子機制研究較少，我們構建的Flag-MDM2真核表達載體將為探討MDM2的其他功能奠定基礎。

[1]Popowicz G M,Czarna A,Wolf S,et al.Structures of low mo?lecular weight inhibitors bound to MDMX and MDM2 reveal new approaches for p53-MDMX/MDM2 antagonist drug discov?ery[J].Cell Cycle,2010,9(6):1104-1111.

[2]Haupt Y,Maya R,Kazaz A,et al.Mdm2 promotes the rapid degradation of p53[J].Nature,1997,387(6630):296-299.

[3]Wade M,Wang Y V,Wahl G M.The p53 orchestra:Mdm2 and Mdmx set the tone[J].Trends Cell Biol,2010,20(5):299-309.

[4]Tovar C,Graves B,Packman K.MDM2 small-molecule antag?onist RG7112 activates p53 signaling and regresses human tu?mors in preclinical cancer models[J].Cancer Res,2013,73(8):2587-2597.

[5]Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive ge?nomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways[J].Nature,2008,455(7216):1061-1068.

[6]Ito M,Barys L,O'Reilly T,et al.Comprehensive mapping of p53 pathway alterationsrevealsan apparentrole forboth SNP309 and MDM2 amplification in sarcomagenesis[J].Clin Cancer Res,2011,17(3):416-426.

[7]Gembarska A,Luciani F,Fedele C,et al.MDM4 is a key therapeutic target in cutaneous melanoma[J].Nat Med,2012,18(8):1239-1247.

[8]Lam S,Lodder K,Teunisse A F,et al.Role of Mdm4 in drug sensitivity of breast cancer cells[J].Oncogene,2010,29(16):2415-2426.

[9]Shibagaki I,Tanaka H,Shimada Y,et al.p53 mutation,mu?rine double minute 2 amplification,and human papillomavirus infection are frequently involved but not associated with each other in esophageal squamous cell carcinoma[J].Clin Cancer Res,1995,1(7):769-773.

[10]Mejia-Guerrero S,Quejada M,Gokgoz N,et al.Characteriza?tion of the 12q15 MDM2 and 12q13-14 CDK4 amplicons and clinicalcorrelationsin osteosarcoma[J].GenesChromo?somes Cancer,2010,49(6):518-525.

[11]Forslund A,Zeng Z,Qin L X,et al.MDM2 gene amplifica?tion is correlated to tumor progression but not to the pres?ence of SNP309 or TP53 mutational status in primary colorec?tal cancers[J].Mol Cancer Res,2008,6(2):205-211.

[12]Gilkes D M,Pan Y,Coppola D,et al.Regulation of MDMX expression by mitogenic signaling[J].Mol Cell Biol,2008,28(6):1999-2010.

[13]Lundgren K,Montes de Oca Luna R,McNeill Y B,et al.Targeted expression of MDM2 uncouples S phase from mito?sis and inhibits mammary gland development independent of p53[J].Genes Dev,1997,15;11(6):714-725.

[14]Jones S N,Hancock A R,Vogel H,et al.Overexpression of Mdm2 in mice reveals a p53-independent role for Mdm2 in tumorigenesis[J].Proc Natl Acad Sci USA,1998,95(26):15608-15612.

[15]Wade M,Li Y C,Wahl G M.MDM2,MDMX and p53 in on?cogenesis and cancer therapy[J].Nat Rev Cancer,2013,13(2):83-96.