腫瘤內皮標志物8同型物Ⅰ基因真核表達載體的構建及其在HEK293F細胞中的表達

劉羽，高麗華，邵勇，王友亮，胡顯文，陳惠鵬

軍事醫學科學院 生物工程研究所，北京 100071

腫瘤內皮標志物8（tumor endothelial marker 8，TEM8）又稱炭疽毒素受體1（anthrax toxin receptor 1，ANTXR1），是Ⅰ型跨膜蛋白，其確切的生理學功能還未知。TEM8蛋白共有3個變體，最長變體TEM8同型物（isoform）Ⅰ是由564個氨基酸殘基構成的單次跨膜糖蛋白，具有較長的富集脯氨酸的胞質尾部，相對分子質量約為（80～85）×103，包括胞外vWA結構域和一個巨大的胞質尾部[1]。體外研究表明，TEM8在多種內皮細胞功能中具有重要作用，其胞外區能結合細胞外基質蛋白，同樣也能結合炭疽毒素保護性抗原。臨床樣本研究表明TEM8在腫瘤內皮細胞中過表達，而在正常成熟組織中表達零星不規則且遠遠低于腫瘤內皮組織[2]。這些發現均暗示了在成熟細胞內TEM8高表達往往是由于異常的脈管生成，如腫瘤脈管系統，即可以將TEM8作為靶向腫瘤內皮組織的治療靶點。

TEM8作為炭疽毒素受體，介導炭疽毒素進入宿主細胞。但在沒有炭疽毒素存在的情況下，TEM8在細胞中的生理功能尚不清楚。在本研究中，我們構建了pcDNA3.1（+）-TEM8-EGFP真核表達載體，并穩定轉染HEK293F細胞，以此得到穩定表達TEM8蛋白的TEM8-EGFP/HEK293F細胞系，為后期實驗研究奠定了良好的基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

人胚胎腎細胞HEK293F由本實驗室貯存；大腸桿菌Trans10感受態細胞購自全式金公司；真核表達載體pcDNA3.1（+）-EGFP由本研究室構建；編碼TEM8基因所需質粒pcDNA3.1（+）-MYC-TEM8由本實驗室構建；Taq DNA聚合酶購自奧賽博公司；DNA限制性內切酶、快速連接酶均購自NEB公司；質粒小量制備盒及DNA膠回收試劑盒為天根公司產品；DMEM/F12培養基購自Hyclone公司；新生胎牛血清（FBS）購自杭州四季青公司；G418、轉染試劑LipofectAMINE 2000均購自Life Technologies公司。

1.2 重組質粒pcDNA3.1（+）-TEM8-EGFP的構建

以質粒pcDNA3.1（+）-MYC-TEM8為模板PCR擴增得到TEM8基因序列全長（1668 bp，優化后）。上游引物為T8up1（5'-CCCAAGCTTACCATGCGGG CACTGCTGGCCAGACTGCTGCTGTGCGTGCTGGTG-3'，含HindⅢ酶切位點）、T8up2（5'-GCTGCTGTGC GTGCTGGTGGTGTCTGACAGTAAAGGGGGCGGAA GGCGAGAAGAC-3'），下游引物為 T8down（5'-CGC GGATCCCTTGGCCTTGGAGGGGGTC-3'，含 BamHⅠ酶切位點）（引物由Life Technologies公司合成）。首先用上游引物T8up2和下游引物T8down以質粒pcDNA3.1（+）-MYC-TEM8為模板進行PCR反應擴增，以回收后的產物為模板，采用上游引物T8up1和下游引物T8down再次進行PCR反應擴增，凝膠回收得到TEM8基因。將TEM8基因和 pcDNA3.1（+）-EGFP載體分別以HindⅢ和BamHⅠ雙酶切，酶切產物純化后連接并轉化大腸桿菌Trans10感受態細胞后，將其均勻接種在含氨芐西林的LB固體培養基中過夜培育，選取PCR驗證陽性的菌落進行測序。

1.3 細胞培養及重組質粒轉染

HEK293F細胞以1×105/mL的密度接種于6孔培養板，于 37℃、5%CO2孵箱中培養 48 h；用 Lipo?fectAMINE 2000轉染試劑將pcDNA3.1（+）-TEM8-EGFP質粒轉染HEK293F細胞，用含0.5 mg/L G418、8%FBS的DMEM選擇性培養基加壓篩選，采用有限稀釋法制備單克隆細胞，最終得到穩定表達TEM8蛋白的單克隆細胞系TEM8-EGFP/HEK293。

1.4 細胞表達蛋白的鑒定

過表達TEM8的TEM8-EGFP/HEK293細胞及HEK293細胞生長至密度約90%時裂解細胞，裂解液于95℃變性5 min，并等量上樣，經SDS-PAGE后恒壓電轉至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入用5%脫脂奶粉以1∶1000稀釋的抗TEM8抗體ab21270，于靜音混合器上37℃孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，用辣根過氧化酶偶聯的羊抗兔IgG二抗1∶5000稀釋，37℃孵育1 h，TBST洗膜3次，室溫避光顯色5 min，壓片顯影。

2 結果

2.1 重組質粒pcDNA3.1（+）-TEM8-EGFP的構建、酶切鑒定及DNA序列測定

經2步PCR擴增獲得目的基因TEM8（圖1）。經HindⅢ和BamHⅠ雙酶切及連接轉化，得到含有目的基因的重組質粒，酶切鑒定證明重組質粒攜帶目的基因（圖2），測序結果顯示pcDNA3.1（+）-TEM8-EGFP重組質粒序列無誤（圖3為質粒示意圖）。

2.2 重組質粒 pcDNA3.1（+）-TEM8-EGFP在HEK293F細胞中的表達

pcDNA3.1（+）-TEM8-EGFP轉染陽性細胞經G418加壓篩選和有限稀釋克隆，在96孔板中形成多個單克隆并標記。將陽性克隆于24孔板、6孔板、25 cm2培養瓶中逐級擴大培養，并在熒光顯微鏡下觀察細胞中綠色熒光蛋白的表達，最終得到穩定表達TEM8蛋白的陽性細胞系（圖4）。

2.3 細胞的蛋白表達鑒定

圖1 重組質粒pcDNA3.1（+）-TEM8-EGFP的PCR擴增結果

圖2 重組質粒pcDNA3.1（+）-TEM8-EGFP的酶切鑒定

為驗證陽性細胞系所表達的新生蛋白是否為目的基因的表達產物，選擇綠色熒光較強的2株陽性單克隆細胞系 TEM8-EGFP/HEK293F（1）、TEM8-EGFP/HEK293F（5）進行Western印跡，結果如圖5，在相應位置出現2條條帶，相對分子質量約為85×103，證明陽性細胞系表達TEM8蛋白。

3 討論

近年來，靶向破壞腫瘤脈管系統在腫瘤生物學和治療學領域受到眾多研究者的關注。腫瘤血管化提供腫瘤持續發生發展所必需的氧及營養物質[3]。腫瘤通過血管獲得潛在的遷移能力，并且由此能夠緩解其無限增殖導致的低氧環境。若這種血管發生受到抑制或改變，則腫瘤無法從新生脈管系統中得到營養供給，這些腫瘤組織將會饑餓而死。因此，靶向脈管生成而治療腫瘤的發生發展顯得尤為重要。同時這些脈管網絡受腫瘤微環境影響，導致多種蛋白表達改變，應該存在一種新的因子能夠破壞或阻斷腫瘤血管的生長[4]。經過一系列分子技術探究，得到一些集中過表達的蛋白，其中較為特別的就是腫瘤內皮標志物8，其在多種腫瘤脈管中高表達，并且在種屬間高度保守[5]。

圖3 pcDNA3.1（+）-TEM8-EGFP重組質粒圖譜

圖4 穩定表達TEM8蛋白的TEM8-EGFP/HEK293F細胞系

圖5 Western印跡檢測2株TEM8-EGFP/HEK293F單克隆細胞系中TEM8的表達

TEM8同型物Ⅰ具有結合胞外基質的胞外區及富含Cys的胞質尾部。其胞外區主要由包含一個金屬離子結合位點（MIDAS）的vWA結構域組成，與整合素的結構域Ⅰ有很高的同源性。體外研究發現TEM8在多種內皮細胞中具有一定作用[6]，且其胞外區能結合胞外基質蛋白[7]及炭疽毒素保護性抗原[8]。已有研究表明，TEM8具有調節內皮細胞遷移[9]、黏附[10]及腫瘤血管生成的功能[11]。有部分研究表明，TEM8具有調節內皮細胞遷移和黏附的功能。

我們構建、表達了TEM8同型物Ⅰ與EGFP的融合蛋白，目的在于進一步研究TEM8的正常生理功能及其在腫瘤血管形成中的機制。EGFP的表達可以快速并準確地顯示TEM8在細胞內的表達及定位，大大縮短了篩選TEM8蛋白表達陽性細胞系的時間，并可以進一步通過活細胞工作站直接觀測不同細胞因子刺激下TEM8在細胞中的定位。實驗結果證明真核載體轉染后能使低表達TEM8的HEK293F細胞顯著表達TEM8蛋白。以上結果為進一步研究TEM8的生理功能等奠定了基礎。

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