人1型酪蛋白激酶的真核表達及其在腫瘤細胞中的定位

冀全博，徐小潔，張強，康磊，李玲，黃蓉，周麗英 ，王榮福，王巖，葉棋濃

1.軍事醫學科學院 生物工程研究所，北京 100850；2.解放軍總醫院 骨科，北京 100853；3.北京大學 第一醫院核醫學科，北京 100034

1型酪蛋白激酶（casein kinase 1，CK1）是一類具有獨特理化特性的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其家族序列高度保守[1]，并廣泛存在于哺乳動物、酵母等真核生物的細胞質、細胞核、細胞膜及細胞骨架等部位[2]，參與調節包括基因表達、囊泡運輸、生物節律、DNA損傷修復、細胞周期調控等多種過程[3]。

q CK1表達水平及活性的變化能促進腫瘤發生，并通過一系列細胞內信號通路調節腫瘤的進展[4]。為此，我們構建了帶有FLAG標簽的CK1的真核表達載體，并研究該激酶在骨肉瘤U2OS細胞、乳腺癌ZR-75-1細胞、肝癌HepG2細胞中的表達及定位情況，為進一步深入探討腫瘤發生的潛在分子標記物和藥物治療靶點的深層次研究奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

骨肉瘤U2OS細胞、乳腺癌ZR-75-1細胞、肝癌HepG2細胞由本室傳代培養；大腸桿菌DH5α、人乳腺文庫、pCMV-Tag2B載體為本室保存；XhoⅠ和HindⅢ限制性內切酶、高保真primerSTAR DNA聚合酶、T4DNA連接酶、Taq酶為TaKaRa公司產品；PCR回收試劑盒、膠回收、質粒提取試劑均來自Pro?mega公司；轉染試劑Vigofect為威格拉斯生物技術有限公司產品；小鼠源抗FLAG標簽單抗（mAb）αm-FLAG和HRP標記的抗FLAG標簽小鼠源mAb購自Sigma公司；FTTC標記的山羊抗小鼠二抗購自San?ta Cruz公司；引物由北京賽百盛生物技術公司合成；測序由北京奧科生物技術有限責任公司完成。

1.2 人CK1全長編碼區序列的擴增

以人乳腺文庫為模板，根據文獻報道的人CK1 CDS序列合成上游引物（5'-CGGGATCCATGTCGG GACCCGTGCCAAGCAG-3'）和下游引物（5'-CGGA ATTCTTACTGCTGAGCGCCAGCGGCAGC-3'），PCR擴增CK1編碼區全長（95℃ 5 min，以95℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 1 min進行32個循環，72℃延長7 min；使用高保真primerSTAR DNA聚合酶）。

1.3 重組表達質粒的構建、鑒定

用XhoⅠ和HindⅢ限制性內切酶雙酶切pCMVTag2B載體（37℃，4 h），經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，膠回收載體大片段；將PCR產物膠回收后用XhoⅠ和HindⅢ雙酶切，形成帶有黏性末端的雙鏈，用T4DNA連接酶連接到pCMV-Tag2B載體中，得到重組質粒pCMV-Tag2B-CK1，將其轉化大腸桿菌DH5α，挑選克隆，培養后菌液PCR鑒定陽性的提取質粒，用XhoⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定，酶切鑒定正確的克隆送北京奧科生物公司測序。

1.4 哺乳動物細胞的培養與轉染

將骨肉瘤U2OS細胞、乳腺癌ZR-75-1細胞、肝癌HepG2細胞接種于6孔板中含10%胎牛血清的雙抗DMEM培養基中，接種細胞密度以80%為宜，培養12 h后按常規方法進行轉染，轉染前1 h換液。將2 μL Vigofect與100 μL NaCl混合，取5 μg重組質粒與100 μL NaCl混合，再將上述2種溶液混合，室溫放置15 min，加入6孔板中，并以同樣的方法轉染空pCMV-Tag2B作為對照，37℃、5%CO2條件下常規培養，轉染后4～6 h換液。

1.5 SDS-PAGE和Western印跡檢測FLAG-CK1的表達

將pCMV-Tag2B-CK1重組質粒分別轉入骨肉瘤U2OS細胞、乳腺癌ZR-75-1細胞、肝癌HepG2細胞，24 h后收集細胞，提取蛋白，加入2×SDS上樣緩沖液，100℃水浴15 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液進行SDS-PAGE后，電轉移至硝酸纖維素膜上，用50 g/L脫脂奶粉在室溫下封閉1 h，加入用50 g/L脫脂奶粉以1∶3000稀釋的HRP標記的抗FLAG標簽的小鼠mAb，室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次，每次5 min；化學發光法顯色5 min，壓片顯影。

1.6 細胞免疫熒光檢測FLAG-CK1的細胞定位

將骨肉瘤U2OS細胞、乳腺癌ZR-75-1細胞、肝癌HepG2細胞分別接種于6孔板，用pCMV-Tag2BCK1重組質粒分別轉染細胞，常規培養24 h后棄培養基，用PBS洗3次，胰酶消化2 min；分別將3種消化后的細胞接種至12孔板中繼續培養，接種密度以5%為宜，12孔板各孔中預先分別置入3個1 cm圓形蓋玻片，待細胞貼壁后棄培養基，加入預先配制的40 g/L的多聚甲醛室溫固定30 min；用含10%山羊血清的PBS封閉30 min，加入1∶200稀釋的小鼠源抗FLAG標簽的mAb（αm-FLAG），37℃孵育1.5 h；用含10%山羊血清的PBS洗3次，每次10 min；用1∶200稀釋的FITC標記的山羊抗小鼠二抗（αm-FITC）37℃孵育1 h，用1×PBS漂洗3次，每次10 min；用終濃度為1 μg/mL的DAPI染細胞核10 min，用1×PBS漂洗3次，每次5 min；在熒光顯微鏡下觀察細胞內融合蛋白2B-FLAG-CK1的表達及定位。

2 結果

2.1 人CK1基因編碼區的擴增

以人乳腺文庫作為模板，PCR擴增獲得約1170 bp的產物，與預期片段大小一致（圖1）。

2.2 pCMV-Tag2B-CK1重組質粒的構建與鑒定

圖1 PCR擴增目的基因

用XhoⅠ和HindⅢ雙酶切PCR產物后與經同樣雙酶切的pCMV-Tag2B載體連接，轉化大腸桿菌DH5α，培養后菌液PCR鑒定，篩選目的條帶大小接近1170 bp的陽性克隆（圖2），提取質粒后酶切鑒定，可切出2條長度分別約為5000和1170 bp的條帶（圖3），表明CK1基因的CDS序列已插入pCMVTag2B上游的多克隆位點中。測序結果顯示，與已知人CK1基因的編碼序列完全一致（序列略）。

2.3 SDS-PAGE和Western印跡檢測CK1融合蛋白的表達

將構建的pCMV-Tag2B-CK1重組質粒分別轉染骨肉瘤U2OS細胞、乳腺癌ZR-75-1細胞、肝癌HepG2細胞，24 h后提取蛋白進行SDS-PAGE，Western印跡檢測2B-FLAG-CK1蛋白的表達。結果表明，在相對分子質量約40 000處能夠檢測到明顯的特異性條帶，說明2B-FLAG-CK1融合蛋白在上述3種細胞中獲得正確表達，而空載體則無蛋白表達（圖4）。

2.4 細胞免疫熒光檢測2B-FLAG-CK1在骨肉瘤U2OS細胞、乳腺癌ZR-75-1細胞、肝癌HepG2細胞中的定位

圖2 菌液PCR鑒定

圖3 表達載體的雙酶切鑒定

圖4 重組蛋白表達的Western印跡

將pCMV-Tag2B-CK1重組質粒分別轉染骨肉瘤U2OS細胞、ZR-75-1細胞、HepG2細胞，24 h常規培養并處理后，于熒光顯微鏡下觀察CK1融合蛋白在細胞中的定位（圖5），發現2B-FLAG-CK1蛋白在3中細胞的胞核和胞質中均有分布，在U2OS、HepG2細胞胞質中的信號強于胞核中，而在ZR-75-1細胞胞核中的信號強于胞質中。

3 討論

腫瘤的發生發展與蛋白質磷酸化水平的異常調節密切相關，而蛋白質磷酸化作為蛋白質轉錄及轉錄后修飾（磷酸化、甲基化、乙酰化、糖基化等）中的重要類型之一，參與調控代謝、信號轉導、細胞分裂等不同過程[5]。CK1作為鈣黏著蛋白功能的重要調控因子，可通過與細胞膜、細胞骨架、某些細胞表面受體及細胞核因子的穩定結合，參與蛋白質的級聯磷酸化過程[6]，從而調節生理功能[7]。

CK1還參與調節Wnt、Hedgehog信號通路及細胞周期、細胞凋亡，通過磷酸化作用直接或間接參與Dv1-1、APC、Axin和β-catenin的磷酸化反應[8]，并能夠 與 MDM2（mutine double minute chromosome 2）共同調節p53蛋白的磷酸化[9-10]及缺氧誘導因子HIF-1的調控[11]，還能負向調控E鈣粘連蛋白介導的細胞-細胞黏附[12]。CK1調節功能的紊亂，可影響腫瘤的發生與發展。鑒于此，我們設計并完成了CK1真核表達載體的構建，并確定了其在不同腫瘤細胞中的定位。

圖5 細胞免疫熒光檢測2B-FLAG-CK1在腫瘤細胞中的定位

另已發現，CK1δ/ε在結腸癌、胰腺癌、乳腺癌中可通過抑制凋亡或激活β-catenin信號通路影響腫瘤進展[10]。CK1γ2可磷酸化轉移性腫瘤抗原1（me?tastastic tumor antigen 1，MTA1），并調節其功能[13]，而最近對MTA1轉基因小鼠的研究，證明CK1在乳腺癌的發生發展中也有重要作用[14]。研究還表明，CK1可作為惡性黑色素瘤的診斷分子標記物，對腫瘤的侵襲和代謝產生影響[15]。

因此，CK1的真核表達及其在不同腫瘤細胞系中的定位研究，對闡明CK1調節細胞進程的作用，更好地研制抗腫瘤藥物、制定腫瘤治療新策略具有重要意義。

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