人Six1基因真核表達載體的構建及其生物學功能研究

李淑月，徐小潔，韓聚強，王濤，符靜，李玲，冀全博，王宣，楊國鋒，葉棋濃

1.軍事醫學科學院 生物工程研究所，北京 100850；2.河北醫科大學，河北 石家莊 050017；3.北京軍區總醫院，北京 100700

Six1（sineoculis homeobox homolog 1）是一種與乳腺癌有關的同源結構域轉錄因子[1]，其編碼基因位于人染色體14q23上。Six1是由一個高度保守的同源異型結構域（homeodomain，HD，61個氨基酸殘基）和Six結構域（Six domain，SD，110～115個氨基酸殘基）組成的復合結構，該結構與DNA結合的特異性決定了其靶基因的特異性，為腦、耳、眼、肌肉和腎等多種器官發育所必需[2-4]。當Six1調控異常時，不但使胚胎發育和組織器官出現異常形態結構、胚胎死亡，而且在腫瘤發生和轉移中發揮關鍵作用[5]。同時，Six1在44%的早期和90%的轉移性乳腺癌中過表達[7]。研究表明，Six1可以通過升高血管內皮生長因子C（vascular endothelial growth factor C，VEGFC）的水平來促進腫瘤淋巴管的形成及淋巴轉移[1]。我們擬構建Six1的真核表達載體，并驗證其升高VEGF-C水平的功能，為進一步探討Six1與腫瘤的關系奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

人胚腎293T細胞、乳腺癌ZR75-1細胞由本室傳代培養；pXJ-40-myc載體為本實驗室保存；Vigo?Fect為威格拉斯生物技術有限公司產品；限制性內切酶、DNA連接酶、PCR試劑均購自TaKaRa公司；質粒提取、膠回收、PCR回收試劑盒購自Promega公司；DMEM及小牛血清均購自Gibco公司；引物合成由北京賽百盛生物技術公司完成；測序由北京奧科生物技術有限責任公司完成。

1.2 myc-Six1重組質粒的構建與測序

以本實驗室保存的乳腺文庫為模板，根據Six1的編碼序列合成上游引物5'-CGGGATCCATGTCG ATGCTGCCGTCGTTTGGC-3'和下游引物5'-CCC AAGCTTTTAAGCCCGGGAGAGAATAGTTTG-3'，采用PCR擴增人Six1的編碼序列（擴增程序：95℃預變性5 min，以95℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸1 min進行31個循環，72℃延長7 min），用膠回收試劑盒回收PCR產物。

用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切pXJ-40-myc載體，經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，膠回收載體大片段；將PCR片段回收后再用BamHⅠ和HindⅢ酶切，形成帶有粘端的雙鏈，用T4DNA連接酶連接入pXJ-40-myc載體，轉化大腸桿菌DH5α，挑選克隆，搖菌并提質粒，用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定，將鑒定正確的克隆送北京奧科生物公司測序。

1.3 哺乳動物細胞轉染和Western印跡檢測

用含雙抗、100 mL/L胎牛血清的DMEM培養基將293T細胞接種于6 cm皿中，接種量以轉染時細胞密度達到80%為宜，培養24 h后進行轉染，轉染前1 h換液。轉染方法參考文獻[8]。將4 μL Vigo?Fect與200 μL NaCl混合，再將總量為10 μg的重組質粒與200 μL NaCl混合，然后將上述2種溶液輕輕混合，室溫放置15 min，加入6 cm皿中，并以同樣方法轉染空pXJ-40-myc載體作為對照，37℃、50 mL/L CO2常規培養，4～6 h換液。質粒轉染293T細胞24 h后收集細胞蛋白，加入2×SDS加樣緩沖液，煮沸10 min，高速離心2 min，取上清液進行SDSPAGE后電轉移至硝酸纖維素膜上；用5%脫脂奶粉于4℃封閉過夜，加入用5%脫脂奶粉以1∶5000稀釋的用HRP標記的抗myc標簽鼠單克隆抗體，室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次，每次5 min；用化學發光法顯色5 min，壓片顯影。轉染重組質粒和空載體后，用上述方法行Western印跡至5%脫脂奶粉，于4℃封閉過夜后，加入用5%脫脂奶粉以1∶5000稀釋的用HRP標記的抗myc標簽鼠單克隆抗體，室溫輕搖1 h，TBST洗膜3次，每次5 min；用化學發光法顯色5 min，壓片顯影。

1.4 總RNA的提取

用上述轉染方法將重組質粒和空載體轉染ZR75-1細胞，24 h后棄培養基，用1×PBS洗滌，用1 mL TRIzol溶液吹下細胞，加0.2 mL氯仿提取蛋白混勻，室溫放置10 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，小心取上清液0.4 mL，加等量異丙醇混勻，-20℃冷凍10 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清，用1 mL 75%乙醇（DEPC水稀釋）洗1次，4℃、12 000 r/min離心5 min后棄上清，用無水乙醇洗1次，4℃、12 000 r/min離心5 min后棄上清，自然干燥約30 min，加入20 μL DEPC水溶解沉淀，即為提取的總RNA。

1.5 qRT-PCR檢測

按文獻方法進行如下實驗[9]。取2 μg總RNA，與1 μL 50 μmol/L的隨機引物混勻，補水至15.9 μL，70℃解鏈5 min，自然冷卻至室溫，加入反轉錄酶、dNTP、RNA酶抑制劑及反轉錄緩沖液，剩余補水至終體積25 μL，42℃反應1 h，95℃滅活5 min，得到反轉錄的cDNA第一鏈，將其按1∶20稀釋，取9.2 μL模板與10 μL SYBR Green Mix（2×）、上下游引物各0.4 μL混勻，進行qRT-PCR，所得數據按2-ΔΔCt公式計算出基因表達的相對量。

2 結果

2.1 myc-Six1重組質粒的構建與鑒定

以實驗室保存的乳癌文庫為模板，PCR擴增人Six1的編碼序列，獲得約870 bp的DNA片段，與預期片段大小一致（圖1）。將PCR產物用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后，與經同樣酶切的pXJ-40-myc載體連接，轉化大腸桿菌DH5α，挑選克隆，進行菌液PCR鑒定，若獲得與目的條帶750 bp大小接近（圖2）的克隆，則初步認為是帶有人Six1基因的陽性重組克隆。將所得陽性克隆提質粒，經酶切鑒定，可切出2條長度分別約為5 000和750 bp的條帶，而相應的空載體酶切只見大片段，符合預期結果（圖3）。DNA序列測序結果表明，插入片段的DNA序列與人Six1基因的編碼序列完全一致（數據略）。

2.2 Western印跡檢測myc-Six1在293T細胞中的表達

將構建的myc-Six1重組質粒和空載體分別轉染293T細胞系，24 h后提取蛋白進行SDS-PAGE，Western印跡檢測myc-Six1蛋白的表達。結果顯示，轉染重組質粒后，用myc-HRP抗體能在相對分子質量約31×103處檢測到明顯的特異性條帶，空載體無條帶（圖4），說明myc-Six1重組蛋白在293T細胞中能夠正確表達。

2.3 myc-Six1在mRNA水平升高VEGF-C

根據文獻報道，Six1可通過升高VEGF-C水平來促進乳腺癌淋巴管的形成及淋巴轉移[1]。為證明構建的myc-Six1可以上調VEGF-C的表達，我們將myc-Six1和空載體分別轉染乳腺癌ZR75-1細胞，收集細胞提取總RNA，行qRT-PCR，引物采用文獻報道的序列[6]。結果顯示，轉染myc-Six1后，ZR75-1細胞中VEGF-C的mRNA水平較轉染空載體后明顯升高（圖5）。

3 討論

乳腺癌是嚴重威脅女性健康的主要惡性腫瘤，占女性惡性腫瘤死亡率的首位。乳腺癌常早期發生淋巴結轉移，淋巴結轉移的有無及淋巴結受累的程度，是決定乳腺癌分期和臨床治療方案選擇的關鍵，也是臨床評估乳腺癌患者病情及預后的重要指標。因此，研究乳腺癌淋巴結轉移機制具有重要意義。研究表明，VEGF-C與乳腺癌淋巴管生成和淋巴結轉移密切相關。

圖1 PCR擴增人Six1的編碼序列

圖2 重組質粒myc-Six1的菌液PCR結果電泳圖譜

圖3 重組質粒myc-Six1的BamHⅠ/HindⅢ雙酶切電泳圖譜

圖4 Western印跡檢測myc-Six1的表達

圖5 qRT-PCR檢測Six1對VEGF-C的影響

VEGF-C是VEGF家族的新成員，其基因定位于染色體4q34，主要由腫瘤細胞產生，是較特異的淋巴管生成因子[10]，可以促進淋巴管內皮細胞增生，從而使淋巴管增生或擴張，增大腫瘤淋巴道轉移的機會[11]，并增強脈管的通透性，改變淋巴管內皮黏附特性或表面趨化因子的表達，從而促進腫瘤轉移[12]。VEGF-C還可誘導新生淋巴管與己存在淋巴管愈合,使腫瘤細胞從新生淋巴管進入淋巴結，發生淋巴結轉移，并通過淋巴系統向全身其他器官擴散[13]。

Six1屬于同源異型結構域Six家族，在許多惡性腫瘤如乳腺癌[14]、橫紋肌肉瘤[15]、腎母細胞瘤[5]等中表達增高。Six1對惡性腫瘤的增殖和轉移起到了促進作用[16]，并且能夠引起促淋巴生成因子VEGF-C的轉錄，這對淋巴管生成及淋巴轉移也是必需的[1]。

本實驗構建的myc-Six1在真核細胞中獲得了表達，同時通過qRT-PCR證明了Six1能夠在mRNA水平升高VEGF-C。這為進一步研究Six1基因的功能，以及Six1與VEGF-C及乳腺癌轉移的關系奠定了基礎。

[1]Wang C A,Jedlicka P,Patrick A N,et al.SIX1 induces lym?phangiogenesis and metastasis via upregulation of VEGF-C in mouse models of breast cancer[J].Clin Invest,2012,122(5):1895-1906.

[2]Ozaki H,Nakamura K,Funahashi J,et al.Sixl controls pat?terning of the mouse otic vesicle[J].Development,2004,131(3):551-562.

[3]Zou D,Silvius D,Fritzsch B,et al.Sixl are essential for ear?ly steps of sensory neurogenesis in mammalian cranial plac?odes[J].Development,2004,131(22):5561-5572.

[4]Konishi Y,Ikeda K,Iwakura Y,et al.Sixl and Six4 pro?mote survival of sensory neurons during early trigeminal gan?gliogenesis[J].Brain Res,2006,1116(1):93-102.

[5]LiC M,GuoM,Borczuk A,etal.Geneexpressionin Wilms'tumormimicsthe earliestcommitted stage in the metanephric mesenchymalepithelial transition[J].Am J Pathol,2002,160(6):2181-2190.

[6]Zhu C,Qi X,Chen Y,et al.PI3K/Akt and MAPK/ERK1/2 signaling pathways are involved in IGF-1-induced VEGF-C upregulation in breast cancer[J].J Cancer Res Clin Oncol,2011,137(11):1587-1594.

[7]Ford H L,Kabingu E N，Bump E A,et al.Abrogation of the G2 cell cycle checkpoint associated with overexpression of HSIX1:a possible mechanism ofbreastcarcinogenesis[J].Proc Natl Acad Sci USA,1998,95(21):12608-12613.

[8]Xu X,Fan Z,Kang L,et al.Hepatitis B virus X protein re?presses miRNA-148a to enhance tumorigenesis[J].Clin Invest,2013,123(2):630-645.

[9]Han J,Xu X,Qin H,et al.The molecular mechanism and potential role of heat shock-induced p53 protein accumulation[J].Mol Cell Biochem,2013,378(1-2):161-169.

[10]蔡紹朋,岳喜成,李德群,等.TIP30與VEGF-C在乳腺癌中的表達及意義[J].腫瘤學雜志,2012,18(6):408-412.

[11]van der Auwera I,van Laere S J,van den Eynden G G,et al.Increased angiogenesis and lymphangiogenesis in inflamma?tory versus noninflammatory breast cancer by real-time re?verse transcriptase-PCR gene expression quantification[J].Clin Cancer Res,2004,10(23):7965-7971.

[12]Nathanson S D.Insights into the mechanisms of lymph node metastasis[J].Cancer,2003,98(2):413-423.

[13]王虎霞,盛薇,王光輝,等.乳腺癌VEGF-C mRNA的表達與淋巴結轉移的關系[J].西安交通大學學報,2009,30(4):470-473.

[14]Reichenberger K J,Coletta R D,Schulte A P,et al.Gene amplification is a mechanism of Six1 overexpression in breast cancer[J].Cancer Res,2005,65(7):2668-2675.

[15]Yu Y L,Khan J,Khanna C,et al.Expression profiling identi?fies the cytoskeletal organizer ezrin and the developmental ho?meoprotein Six1 as key metastatic regulators[J].NatMed,2004,10(2):175-181.

[16]謝柏臻，陳安民，郭風勁,等.RNAi下調Six1基因對人骨肉瘤細胞增殖和轉移能力的影響[J].中國癌癥雜志,2008,18(8):561-565.