人vasorin蛋白的基因克隆、表達及純化

丁紅梅，趙強，王瑋，李慧，劉農樂，李潔，蘇雪婷，黃皚雪，房濤，李少華，邵寧生

1.軍事醫學科學院 基礎醫學研究所，北京 100850；2.武警后勤學院 生物化學與分子生物學教研室，天津 300162

人vasorin（VASN）蛋白在果蠅中的同源蛋白又稱為SLIT-like 2（SLITL2），關于該蛋白的研究報道相對較少。正常情況下，VASN蛋白主要在大動脈的血管平滑肌細胞表面強表達，部分脫落成為分泌型；VASN mRNA在腎臟和胎盤中少量表達，在其他正常組織如心、腦、結腸、胸腺、肝臟等中微弱表達[1]。

研究發現，VASN能夠參與中樞神經系統和血管形成[1-2]，主要通過下調TGF-β參與損傷血管的應答反應，最終影響血管壁的形成。VASN蛋白能夠結合TGF-β，減弱TGF-β的信號傳導，吸引血管內皮細胞的遷移和誘導其形成血管樣結構，并抑制白細胞的遷移[2]。

TGF-β與腫瘤發生、發展密切相關，在調節腫瘤細胞的增殖和分化、抑制機體免疫功能、增加血管生成、誘導細胞外基質的產生而促進腫瘤的侵襲和轉移中均具有重要作用。而在腫瘤的發展過程中，腫瘤誘導的新生血管形成、腫瘤細胞和內皮細胞之間的“通訊”一直被認為是最重要的。因而，VASN與TGF-β通路、腫瘤的關系引起我們的關注[5]。

生物信息學分析發現，VASN蛋白是一種典型的Ⅰ型膜蛋白，含有串聯的富含亮氨酸（LRR）結構域、表皮生長因子（EGF）樣結構域和纖連蛋白Ⅲ（FN3）結構域，而其他含有這些結構域的細胞外基質蛋白和黏附分子通常都具有多個結合分子，通過多條通路發揮生物學功能[3]。此外，該蛋白名稱的來源蛋白——SLIT蛋白家族成員（包括1、2、3），同樣在細胞膜表面和細胞外分泌表達，同樣在神經軸突形成和血管形成中具有重要作用，且盡管與VASN/SLITL2蛋白一級序列的同源性并不高，但同樣含有串聯的LRR、EGF樣結構域，另外還有層粘連蛋白G樣模件，近年來多篇報道認為SLIT蛋白在多種實體瘤中表達，并與腫瘤的惡性程度相關，是抑制腫瘤細胞侵襲的重要靶分子，其機制可能是通過內皮細胞表面的受體Roundabout（Robo）介導的信號通路促進新生血管形成、促進腫瘤細胞增殖、抑制腫瘤細胞凋亡抑制白細胞遷移等[4]。因此，VASN與TGF-β通路、腫瘤的關系也是我們實驗室的研究方向。

由于有關VASN的研究報道較少，且沒有商品化VASN標準品出售，因此，表達、純化VASN蛋白對于深入研究該蛋白的生物學功能具有重要意義。我們運用PCR技術，從人肝癌細胞株HepG2的cDNA中擴增獲得VASN基因，將其克隆至pET28a載體中，轉化大腸桿菌BL21（DE3）并進行誘導表達，利用載體上的His標簽純化了融合蛋白。

1 材料和方法

1.1 材料

人肝癌細胞HepG2購自上海細胞庫；大腸桿菌DH5α、BL21（DE3）菌株，原核表達載體pET28a均由本室保存；高效克隆PCR產物專用載體pMD18T購自TaKaRa公司；Ni2+金屬螯合層析柱購自GE公司；限制性核酸內切酶、T4DNA連接酶、質粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒均購自Promega公司；兔抗人VASN單克隆抗體購自Abnova公司；HRP標記的羊抗兔IgG購自Santa Gruz公司；TRIzol試劑為Invit?rogen公司產品；通用引物oligo-dT由上海生工公司合成；其他化學試劑均為分析純產品。

1.2 cDNA的獲得

用TRIzol法提取HepG2細胞總RNA。取總RNA 1 μg、oligo-dT 0.5 μg，用DEPC水補足5 μL，70℃變性5 min后，加入M-MLV逆轉錄緩沖液4 μL、25 mmol/L MgCl22.4 μL、25 mmol/L dNTP 0.4 μL、DEPC水6.7 μL、40 U/μL核糖核酸酶抑制劑0.5 μL、M-MLV逆轉錄酶1 μL組成20 μL體系，42℃反應1 h后70℃處理15 min以滅活逆轉錄酶，制備的cDNA保存于-20備用。

1.3 目的基因的擴增及鑒定

引 物 P1（3'-gggaattccatatgtgcccatccggctgccagt-5'）和 P2（5'-ccggaattcgagcggcaggttgccctcgc-3'）各100 ng、cDNA 10 ng，按常規PCR步驟加入Taq酶、dNTP、1×Taq酶緩沖液，用ddH2O補至100 μL體系，運行PCR程序（95℃ 10 min，94℃ 40 s，55℃ 40 s，72℃ 40 s，30個循環，末次循環后延伸10 min）。對PCR產物進行瓊脂糖電泳鑒定并分析，確定獲得擴增產物片段。將PCR產物進行切膠回收、純化，獲得目的基因片段。將目的基因片段與高效克隆PCR產物專用載體pMD18-T連接，并轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，挑取陽性克隆測序，獲得重組質粒pMD18-T-VASN。引物合成及測序均由上海生工生物工程有限公司完成。

1.4 重組表達質粒的構建及鑒定

對測序正確的陽性質粒pMD18-T-VASN進行質粒的提取，詳細步驟參照小量質粒提取試劑盒操作說明書。提取的質粒用限制性核酸內切酶NdeⅠ/EcoRⅠ雙酶切，用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段；用NdeⅠ/EcoRⅠ雙酶切大腸桿菌表達載體pET28a，回收載體片段；將上述酶切片段于16℃連接過夜，連接產物轉化大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞，培養后挑取克隆接種于5 mL含100 mg/L卡那霉素的LB培養基，37℃搖床上振蕩培養過夜；收集菌液提取質粒，以質粒為模板，用引物P1和P2進行PCR鑒定及NdeⅠ/EcoRⅠ雙酶切鑒定，鑒定正確的質粒送上海生工生物工程有限公司測序。

1.5 目的蛋白的誘導表達

將轉化有pET28a-VASN表達質粒的大腸桿菌BL21（DE3）/pET28a-VASN于37℃培養過夜，然后按照1∶100的比例擴大培養，37℃、200 r/min振蕩培養至細菌D600nm值為0.6以上時，加入誘導劑IPTG至終濃度為1 mmol/L,37℃條件下繼續振搖6 h，離心收集菌體，制備電泳樣品，行10%的SDS-PAGE，對轉化有pET28a對照質粒的大腸桿菌BL21（DE3）/pET28a做同樣處理。

1.6 目的蛋白的表達形式分析及純化

將電泳鑒定正確的陽性菌液進行目的蛋白表達。菌液按1∶100的比例接種振蕩培養過夜，次日晨繼續按1∶100轉接入400 mL LB培養基中，待細菌D600nm值為1.0時，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，誘導表達6 h；4℃條件下收集菌體，將菌體沉淀懸浮于1×PBS液中，置冰上超聲波破碎菌體（超聲功率400 W，超聲10 s間隔20 s，時間30 min），4℃離心，取上清與沉淀分別進行SDS-PAGE，以確定目的蛋白是否存在可溶性表達。采用Ni2+金屬螯合層析柱純化目的蛋白，按照GE公司操作手冊進行。

1.7 目的蛋白的Western印跡鑒定

將誘導后的菌體總蛋白，及誘導后的菌體超聲波沉淀和上清行SDS-PAGE，以兔抗人VASN兔單克隆抗體（1∶300）為一抗、HRP標記的羊抗兔IgG（1∶8000）為二抗，行Western印跡鑒定。

2 結果

2.1 VASN基因的克隆及鑒定

以肝癌細胞HepaG2的cDNA為模板，PCR擴增得到目的片段，1%瓊脂糖電泳分析表明，擴增的片段與預期1667 bp大小一致（圖1）。將PCR產物純化后克隆至高效克隆載體pMD18-T中，隨機挑取4個克隆，以菌液為模板行PCR擴增鑒定，電泳結果發現1～3號菌液的結果與預期一致（圖2）。將1號菌液送交公司測序，序列結果分析比對證明擴增的目的基因胞外區片段序列及讀框正確。

2.2 pET28a-VASN表達載體的構建

選取測序結果正確的克隆，提取質粒，NdeⅠ/EcoRⅠ酶切回收目的片段，與經相同酶切的表達載體pET28a連接，連接產物轉化大腸桿菌BL21（DE3），獲得重組表達質粒pET28a-VASN。隨機挑取5個克隆，以菌液為模板行PCR擴增鑒定，電泳結果發現1、4、5號菌液的結果與預期一致，基因片段長度約為1700 bp（圖3）。將1號菌液送交公司測序，序列結果分析比對證明擴增的目的基因片段序列及讀框正確，表明目的基因已正確克隆入pET28a表達載體。

2.3 重組蛋白VASN的誘導表達及鑒定

重組大腸桿菌 BL21（DE3）/pET28a-VASN 經IPTG誘導表達后，進行10%的SDS-PAGE分析。結果表明，相對蛋白分子質量約61×103處有一條較為明顯的特異蛋白條帶，與預期一致，且在D600nm值為0.8時誘導的相對表達量高（圖4）。將誘導表達菌體經超聲波破碎后離心，將上清與沉淀分別進行SDSPAGE，發現目的蛋白主要集中于包涵體中（圖5）。為了進一步確證表達的目的蛋白及表達形式，將菌體總蛋白、超聲波上清及包涵體經10%SDS-PAGE分離后轉移至PVDF膜，Western印跡鑒定表達的蛋白及存在形式，結果表明誘導的蛋白被VASN單抗特異識別，且僅在包涵體中存在，上清中檢測不到目的蛋白（圖6）。

圖1 VASN cDNA擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳鑒定

圖2 pMD18-T-VASN克隆的PCR鑒定

圖3 重組質粒pET28a-VASN的PCR鑒定結果

圖4 不同菌液D600nm值條件下IPTG誘導目的蛋白表達的實驗結果

圖5 目的蛋白表達的SDS-PAGE結果

2.4 重組VASN蛋白的純化

目的蛋白經超聲波破碎后，離心收集菌體，經0.5%Tween-20漂洗2次，用8 mol/L尿素溶解包涵體，經0.45 μm膜過濾，過Ni2+金屬螯合柱進行純化，采用0～100 mmol/L咪唑梯度洗脫目的蛋白，電泳結果表明目的蛋白得到了較好的純化（圖7）。

圖6 表達產物的Western印跡

圖7 目的蛋白的Ni2+柱純化結果

3 討論

VASN是Ⅰ型跨膜蛋白，一次跨膜，多肽鏈的N端在胞外，C端在胞內。VASN由673個氨基酸殘基組成，預期相對分子質量為74×103。據報道，VASN在人肺癌細胞株A549及倉鼠卵巢癌細胞株CHO中高表達[6]。研究發現，在肺癌細胞中，ADAM17通過調節VASN的水平控制TGF-β介導的上皮間葉細胞轉化（EMT），臨床試驗也證實抑制ADAM17能夠抗腫瘤[7]，可以作為靶標應用于臨床，成為早期控制腫瘤發展的有效手段。目前的研究主要證明膜型表達的VASN在ADAM17的調控下剪切脫落為分泌型蛋白，分泌型蛋白通過與TGF-β結合并減弱TGF-β信號來發揮調節血管及神經突起形態發生過程[1-3]。VASN胞外區的LRR、EGF樣和FN3結構域通常都具有多個結合分子，因此推測可能還通過多條通路發揮其他生物學功能[8]。因此，表達、純化VASN蛋白的胞外區具有重要意義。我們通過構建VASN胞外區重組表達質粒，轉化大腸桿菌，在IPTG誘導下獲得了重組目的蛋白，并初步進行了Ni2+柱純化，獲得了純度為90%的目的蛋白。經過多種條件探討，包括誘導劑濃度、誘導溫度、菌體吸光度值等，均發現目的蛋白以包涵體形式存在。獲得具有生物學活性的VASN蛋白，對于肝癌的發生發展機制研究具有一定的意義。后續工作仍需要對其進行相關生物學活性檢測，目前這一部分工作仍在進行中。

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