大腸桿菌L-色氨酸合成的代謝流分析

申彤，徐慶陽，張成林，謝希賢

1.天津科技大學 生物工程學院，工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457；2.新疆大學 生命科學與技術學院，新疆 烏魯木齊 830046

L-色氨酸是人體必需的氨基酸，廣泛應用于醫藥、食品和飼料工業等領域，但因目前生產成本較高，限制了其應用規模。近年來，隨著市場需求的加大，色氨酸的生產規模不斷擴大，對生產菌株的要求也越來越高。應用重組DNA技術和相關的遺傳學手段進行有精確目標的基因操作，這一代謝工程新思路已在色氨酸生產菌中得到廣泛應用，大大提高了色氨酸的發酵產酸水平，其育種的高度定向性也大大改善了過去誘變育種的盲目性[1]。代謝流分析（metabolic flux analysis，MFA）是對代謝途徑流量進行測定分析的方法[2]。近年來，人們通過代謝工程方法改變細胞內部的代謝流分布，使其生成更多的目的產物。代謝流分析成為代謝工程中用以指導遺傳操作的理論基礎，是代謝網絡分析的基本方法[3]。

為了使大腸桿菌中心代謝流能更多地進入色氨酸合成的代謝途徑，我們用基因重組技術構建了轉酮酶基因（tktA）和磷酸烯醇式丙酮酸合成酶基因（ppsA）過表達質粒pEML03[4]，增加色氨酸前體物質4-磷酸赤蘚糖（E4P）和磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的濃度，從而提高色氨酸產量。利用Red重組技術敲除貯碳因子基因（csrA），增加色氨酸前體物質PEP的供應量，并在原菌株和敲除csrA基因的菌株中分別轉入pEML03，再對上述菌株進行30 L分批發酵試驗，考察基因重組對色氨酸發酵過程的影響。通過測定在擬穩態下主要代謝物濃度的變化速率，得到了原菌株和重組菌株L-色氨酸合成的代謝流量分布圖，通過對主要路徑和關鍵節點的代謝流分析，闡述了基因操作對L-色氨酸合成代謝流的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

L-色氨酸生產菌TRTH0709（E.coliK12 ΔcsmΔtrpRΔtna/pSV-709）、TRTH1013（TRTH0709含有tktA和ppsA共表達質粒pEML03）、TRTH1105（TRTH0709ΔcsrA）、TRTH1107（TRTH1105含有質粒pEML03）由天津科技大學代謝工程研究室保藏。種子培養基和發酵培養基見參考文獻[5]。酵母粉、蛋白胨（OXOID公司）；Na2SO4、CuSO4·7H2O等其他培養基試劑（天津市北方天醫化學試劑廠）；色氨酸、丙氨酸、纈氨酸、天冬氨酸等（Sigma公司）；2，4-二硝基氟苯（天津德宇生物技術公司）；5 L、30 L發酵罐（上海保興生物設備工程有限公司）；氨基酸專用色譜柱（C18，5 μm，250 mm× 4.6 mm，No.20200031）。

1.2 搖瓶及發酵罐培養

[5]。

1.3 分析方法

菌體生物量、菌體比生長速率μ、葡萄糖濃度、L-色氨酸含量測定見參考文獻[5]；氨基酸的檢測見參考文獻[6]。

2 結果與討論

2.1 L-色氨酸發酵過程曲線

發酵過程中每隔2 h取樣測定菌體的生物量、葡萄糖消耗量及L-色氨酸的生成量。整個發酵過程中以上參數的變化情況曲線見圖1，可以看出TRTH1013在生長早期，生長速度略低于出發菌，但在中后期能維持較高生長速度，最高生物量與TRTH0709相比僅低1.8%，最終色氨酸的產量達到40.2 g/L，增長幅度為11.9%。TRTH1105在對數期與原菌株生長速度幾乎一致，到達穩定期后菌體增速大于原菌株，最高菌體量達到49.0 g/L，比原菌株提高2.9%，色氨酸產量為37.7 g/L，與原始菌株相比提高了5%。TRTH1107的最大生物量為48.5%，比原菌株提高1.9%，色氨酸最終積累量為41.2 g/L，比原菌株提高了15.1%。

從圖1還可看出，發酵進入26 h后，菌體數量基本不再增長，色氨酸在26～28 h期間處于高速增長期，同期耗糖速度也較快。將這段時間假設為擬穩態，細胞生長速度為零，胞內代謝物濃度變化為零。

2.2 重組菌株與出發菌株的代謝流分析比較

圖1 出發菌株和重組菌株的分批發酵試驗

據文獻報道[7-10]，大腸桿菌的代謝網絡包括糖酵解（EMP）、三羧酸（TCA）循環、磷酸戊糖（HMP）途徑、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PPC）催化的回補途徑、磷酸轉移酶系統（PTS）及乙酸、乳酸等代謝副產物的積累。因發酵控制采用零殘糖流加工藝，在進入穩定期后，幾乎無溢流代謝物乙酸、乳酸的積累，因此不考慮乙酸、乳酸的生成途徑。本研究所用菌種為苯丙氨酸和酪氨酸缺陷型，因此代謝途徑中不考慮苯丙氨酸和酪氨酸合成支路。結合上述分析，建立代謝網絡。分別測定并計算擬穩態時期26～28 h的葡萄糖消耗速率、色氨酸生成速率及發酵液中能夠檢測到的丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸和組氨酸的濃度變化速率（表1），分別轉換成摩爾流量后，以葡萄糖的代謝流為100進行標準化處理，用MATLAB軟件計算代謝流分布。初步計算表明各供試菌株在色氨酸發酵中后期由中心代謝途徑r8提供的NADPH已完全能夠滿足氨基酸合成的需要，G6P到Ru5P的反應是不可逆反應，r10的計算結果均為負值，不符合代謝的生化熱力學。在這種情況下r10的反應被關閉[11-12]，因此設定r10為零，在代謝流計算時也不考慮NADPH節點處的反應平衡式。在此前提下，建立的方程組包括20個方程、26個未知數，自由度為6，根據已知參數用MATLAB軟件計算，實際代謝流分布如圖2所示。

代謝流分析結果表明，過表達tktA和ppsA（TRTH1103），使EMP（r3）途徑代謝流減少1.6%，HMP（r11）途徑增加9.6%，TCA循環（r8，r9）減少了7.0%，最終使色氨酸生成途徑代謝流增加了13.3%。敲除csrA基因（TRTH1105），EMP途徑代謝流幾乎未變，HMP途徑增加1.3%，TCA循環增加了1.4%，最終使色氨酸生成途徑代謝流增加了2.1%。在csrA基因敲除菌中轉入tktA和ppsA過表達質粒（TRTH1107），使EMP途徑代謝流減少4.0%，HMP途徑增加13.6%，TCA循環減少了8.0%，最終使色氨酸生成途徑代謝流增加了15.7%。從以上分析數據可以看出，ppsA和tktA分別對PEP和E4P的生成起關鍵作用，2種基因的共同表達能顯著影響中心代謝流，使其轉向色氨酸的生成途徑。敲除csrA基因，會對直接或間接參與PEP代謝的若干酶產生影響，導致細胞內PEP水平提高[13]。以往研究指出[14]，僅憑借PEP胞內濃度的增加對色氨酸產量不會有太大影響，需要同時使色氨酸合成的另一個重要的限制性底物E4P的濃度與PEP相平衡，才能進一步提高色氨酸合成。而tktA和ppsA過表達質粒的轉入令PEP和E4P的濃度同時增加，PEP除了與E4P一起進入色氨酸合成途徑外，還會分流轉化為PYR，進入TCA循環或通過PEP羧化酶催化合成草酰乙酸，并且主要參與PTS葡萄糖的運輸。與PEP相比，E4P沒有競爭途徑分流。所以，2個前體物質中PEP可能存在供應不足的問題，csrA基因的敲除會進一步補充PEP的供應量。從TRTH1107的代謝流分析可以看出，2種遺傳標記的疊加使色氨酸代謝流進一步增加，達到了15.7%。

表1 代謝產物變化速率（26～28 h）（P＜0.05）

圖2 出發菌株和重組菌株色氨酸合成的代謝流分布

從連接中心代謝途徑和色氨酸生成途徑的關鍵節點PEP處的流量分配可以看出，PEP生成OAA的流量，tktA和ppsA過表達菌減少了20%，csrA基因的敲除菌減少了33%，二者標記疊加后減少了47%；由PYR生成PEP的量，3株重組菌分別增加了58%、6.5%和70%。同樣說明tktA和ppsA過表達顯著加強了PYR逆轉生成PEP的流量，單純敲除csrA基因對流量的影響較小，但在tktA過表達的情況下可以明顯加大由PYR生成PEP的流量。以上2項流量分配的變化，有力地促進了PEP進入色氨酸合成途徑的代謝流量。另外，從副產物氨基酸的流量變化的逐漸降低，也可證實tktA、ppsA的過表達和csrA的敲除對出發菌株的色氨酸基因改造是成功的。

3 結論

綜合以上代謝流的分析結果可以看出，針對大腸桿菌中心代謝途徑的基因操作，tktA和ppsA的過表達、csrA的敲除，以及二者的疊加，均能有效改變中心代謝途徑的流量，并增加L-色氨酸生成的代謝流。但tktA和ppsA過表達的影響更為顯著，雖然csrA的敲除對各代謝途徑影響不大，但可以適當補充因分流而造成的PEP的不足，在質粒pEML03存在的情況下能顯著增加L-色氨酸生成的代謝流。從各副產物的流量分析也可以看出仍有繼續使其降低的必要。另外，葡萄糖轉運系統（PTS）消耗了大量PEP，因此對ATP的需求較大使TCA循環的代謝流比例較大，碳代謝流主要消耗在TCA循環，使色氨酸生成途徑的碳代謝流偏低，尋求不消耗PEP的轉運系統代替PTS，能夠較好地解決這個問題。

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