豬木乃伊胎病原體混合感染的多重PCR診斷

王偉丞，劉志杰，梁海英，曾智勇*，湯德元，劉 釗

（1.貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025；2. 貴州大學教學實驗場，貴州 貴陽 550025）

豬圓環(huán)病毒2型感染引起的病毒性疾病，主要與斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征等疾病有關，如豬皮炎腎病綜合征、豬增生性壞死性肺炎、新生仔豬的先天性震顫、豬呼吸道綜合癥、肉芽腫性腸炎、母豬繁殖障礙等，這些疾病對豬的生長、發(fā)育和死亡有較大影響[1]。乙型腦炎是由乙型腦炎病毒引起的一種嚴重威脅人畜健康的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的急性傳染病，豬是JEV最重要的自然增殖動物，發(fā)病豬多出現(xiàn)高熱，精神沉郁或神經(jīng)癥狀，食欲減退，有的出現(xiàn)后肢麻痹、視力減退、搖擺、亂沖撞等癥狀，同時JEV也是導致豬繁殖障礙的重要病原之一[2]。2013年11月，貴州省都勻市某豬場，共有母豬300頭左右，近1個月內，30頭初產母豬中有20頭出現(xiàn)流產，產死胎、木乃伊胎和弱仔現(xiàn)象，母豬無其他明顯癥狀，該豬場配種前1個月曾免疫PRV、PPV、PRRSV、CSFV和JEV疫苗。為查清豬群發(fā)病原因，試驗選用豬繁殖障礙性病毒性疫病六重PCR檢測方法[3]，對送檢的1頭木乃伊胎進行了PRV、PPV、PCV2、PRRSV、CFSV和JEV感染情況的快速診斷，現(xiàn)將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 病料

采集送檢木乃伊胎的肺臟、脾臟、淋巴結和腦組織等置于乳缽剪碎后用PBS按1:5倍稀釋研磨，制成乳懸液，-80 ℃反復凍融3次，12 000 r/min離心10 min，取上清于 -20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

核酸提取試劑盒；PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2.0、DL2000購自寶生物工程(大連)有限公司；DNA凝膠回收試劑盒；pMD19-T Simple Vector；普通質粒小提試劑盒為TIANGEN公司產品；其他化學試劑均為國產分析純。

1.3 引物的設計與合成

根 據(jù)NCBI公 布PRV gE（NC-006151）、PPV NS1（NC-001718）、PCV2 ORF2 (NC-005148）、PRRSV ORF5 (NC-001961)、CFSV E2（X87939）、JEV E(M55506)序列設計多重PCR引物，預期的擴增目的片段長度為178 bp、271 bp、353 bp、433 bp、508 bp和1 015 bp。

1.4 病料中DNA/RNA的抽提

嚴格按TaKaRa公司核酸提取試劑盒說明書提取病料中的核酸。

1.5 多重PCR擴增

以病料核酸為模版進行多重PCR擴增。反應體系為50μL， 2×1StepBuffer 25μL， 核 酸 模 版 5μL，PrimeScript one Step Enzyme Mix 2μL，上下游引物各1μL，共6對引物，RNase Free H2O 6μL。反應條件：50 ℃ 40 min，94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s ，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 個循環(huán) ；72 ℃ 10 min。擴增產物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將經(jīng)膠回收純化的PCR產物與pMD 19-T Simple載體按常規(guī)方法進行連接并轉化至Top10感受態(tài)細胞。挑取白色菌落進行增菌培養(yǎng)，小劑量試劑盒提取質粒DNA，用質粒PCR進行鑒定，并將陽性克隆質粒送大連寶生物公司測序。

2 結果與分析

2.1 解剖病理變化

送檢的木乃伊胎兒全身肌肉褪色，內臟組織粘連、腐化，腦組織液化。

2.2 多重PCR擴增結果

應用已建立的六重PCR檢測技術，對送檢的1份病料進行快速檢測，擴增出了353 bp和1 015 bp左右大小的特異性條帶（圖2），擴增的目的條帶，經(jīng)克隆測序，再次證實其分別為PCV2及JEV基因組片段；結果表明，該病死仔豬同時感染有PCV2和JEV兩種病毒。

3 討論

從發(fā)病情況、病料剖解及實驗室檢測，確診該豬場送檢的木乃伊胎病料同時感染有豬圓環(huán)病毒2型和豬乙型腦炎病毒。該病例中發(fā)生繁殖障礙的均是初產母豬，且母豬本身無明顯癥狀，因此疑似感染有豬細小病毒，但通過實驗室檢測，未檢出PPV，表明僅通過臨床癥狀和病理變化很難對豬場疫情做出確診，確診仍需借助實驗室診斷。

雖然該豬場的母豬都進行了JEV疫苗的接種，但仍然受到JEV的侵襲，免疫失敗的原因可能是該豬場母豬存在JEV的隱性感染，加上豬群中存在PCV2的野毒感染，PCV2可造成豬體免疫抑制，從而使JEV疫苗免疫失敗，豬群暴發(fā)JEV。據(jù)相關研究表明，JEV在貴州地區(qū)隱性感染比較嚴重，感染率達59.97%，其潛在的危害不可忽視，疫苗免疫能夠有效防控本病[4]。豬群中感染PCV2 也較為普遍，但真正發(fā)病或者表現(xiàn)臨床癥狀的較少，且其疫苗價格較高，出于經(jīng)濟利益考慮，很多養(yǎng)殖戶未給豬群免疫PCV2疫苗，但本病例中從木乃伊胎兒檢出PCV2，表明該病毒可通過胎盤垂直傳播而感染仔豬，但仔豬感染后發(fā)病較嚴重，再與其他病毒或細菌繼發(fā)或并發(fā)感染，可造成仔豬群大量死亡。近年來，豬群多病原體混合感染越發(fā)普遍，其中影響最大的就是PRRSV和PCV2的混合感染，因此豬場在做好PRV、PRRSV、CSFV疫苗免疫的同時，需重視對PCV2的防控，豬群接種PCV2疫苗可有效降低發(fā)病率和死亡率，在提高飼料報酬和增重、豬群整齊度等方面有明顯的效果，因此建議有條件的豬場免疫PCV2疫苗。

PCR方法在疾病診斷上具有操作簡便、快速、特異性好、靈敏度高的優(yōu)點，本試驗采用的多重PCR能夠同時檢測多種病原，利于對疾病做出快速準確的診斷，適合大量臨床病料中病原體的快速檢測，具有較大的應用價值。

圖1 病料解剖病理變化

圖2 病料多重PCR擴增產物電泳結果

[1]喬翠，高鳳山，許崇波.豬圓環(huán)病毒2型分子致病機理及相關疾病研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī).2012，39(2):170-173.

[2]湯德元，王鳳，馬萍，等. 乙型腦炎病毒貴州分離株E基因原核表達及其免疫原性的研究[J].畜牧獸醫(yī)學報. 2012，43(8): 1330-1336.

[3]劉志杰，曾智勇，湯德元，等. 豬繁殖障礙病毒性疫病六重PCR檢測方法的建立及應用[J].畜牧獸醫(yī)學報,2012，43(9):1429-1436.

[4]程振濤，陳軍義，岳筠，等.貴州省豬乙型腦炎血清流行病學調查[J].中國人獸共患病學報.2011，27(12):1156-1158.