梅毒螺旋體基因重組抗原及其血清學診斷研究進展

莫顯文

導致人體感染梅毒的致病菌為蒼白螺旋體的亞種-密螺旋體（TP），感染人體的主要致病菌株為Nichols株。梅毒螺旋體的細胞質被3層細胞質外膜包裹著，而暴露于外膜的跨膜蛋白數量較少，但跨膜蛋白在臨床中對于梅毒的診斷確診有著極大的實際價值[1]。在實際的臨床操作中，很難對梅毒螺旋體進行體外培養，確診梅毒的方式由培養梅毒螺旋體替代為利用梅毒螺旋體的重組抗原進行對應的檢測。

1 梅毒螺旋體基因重組抗原的研究進展

1.1 Tpr基因家族 Tpr基因家族涵蓋了12個蛋白，這12個蛋白按照同源性氨基酸的分類應該屬于3個不同的亞型，其中Ⅰ亞型為Tpr C、D、F、I，Ⅱ亞型為Tpr E、G、J，Ⅲ亞型為 A、B、H、L、K[2]。在這 3 個亞型中，在梅毒感染兔的模型中，誘導T細胞以及強烈的抗體反應的為Tpr K，這一實驗結果提示著使用Tpr免疫能夠有效地減弱梅毒患者損傷后病情的進一步發展。在分子結構學上，對于Tpr家族的Ⅰ亞型而言，其中它們的C端和N端高度相似于F端和N端，特別是在Tpr的C、D兩個亞型之間，它們C端結構的相似度高達94%[3]。在對Tpr家族的抗原氨基末端的重組性實驗中發現，這些抗原對于感染梅毒患者的損傷的進展有著一定程度的減弱作用，這些重組抗原很可能起著關鍵作用的階段為梅毒患者的不完全免疫階段。

1.2 TpN15、TpN47、TpN17、TmpA 1989 年 有 學者利用兔子的抗體血清成功的篩查出了Tp基因組中的6個重組克隆，且利用Western法以及電泳法成功的篩選出了TpN15、TmpA、TpN17等3個蛋白[4]。在1996年，相應的學者在通過對梅毒螺旋體的結構的進一步研究中發現，他們利用PCR法對梅毒螺旋體內的基因進行了擴增，并將擴增后的基因插入大腸桿菌內進行了表達，結果獲得了TpN47、TpN35、TpN44.5、TpN29-35、TpN39等抗原，接下來的ELISA法實驗中發現上述抗原中引起抗體滴度最高的為TpN47、TpN17、TpN44.5[5]。在后續的相關實驗中，學者重組并成功表達了TpN47的載體pGEX-2T，并成功證實了其具有免疫原性，同時有學者的相關實驗還成功的證實了TpN47是一種能夠與青霉素進行結合的蛋白，并且發現TpN47與青霉素結合的位點有3個，同時還證實TpN47本身是一種具有鋅依賴性的羧肽。有學者通過重疊多肽的方法成功的找出了位于TpN47上的抗原表位[6]。

1.3 TROMP TROMP對于梅毒具有免疫原性，而在TROMPs的表面可能存在著免疫宿主的介導區和致病力決定區，在TROMP的表面上存在著17-kDa、28-kDa、31-kDa、45-kDa、65-kDa。其中存在于TP內膜原生質體復合物中的主要為17-kDa和45-kDa，而存在于外膜的主要為28-kDa、31-KDa以及65-kDa[7]。在天然重組蛋白質中，28-kDa、31-kDa、65-kDa就天然的具有抗原性質，28-kDa主要在外膜中進行表達，并且與跨膜蛋白存在著高度相似的序列，65-kDa其整體數量雖然較少，但是仍然被認定為具有抗原免疫性，而31-kDa被證明具有能夠形成微管的能力，從而被間接的證實為跨膜蛋白。目前國外的相應研究已經明確，TP分子本身的免疫反應能夠產生高滴度的TP抗體，在上述反應過程中，TROMPs能夠誘導產生對應的抗體。在相關的實驗中發現，只有自然的TP感染才能夠產生真正的血清吞噬作用，而使用滅活的Tp重組抗原并不能夠產生真正意義上的血清吞噬作用[8]。在對TROMP1的各項重組實驗中可以發現，在電子顯微鏡下可以明顯發現在Tp感染的血清中，TROMP1的表達主要是在重組菌的表面表達，相應的實驗還證實對于rTROMP1而言，其定位于E.coil的外膜，并且同時兼有表面抗原性以及微孔體系。

1.4 Tp0155、Tp0751、Tp0483、Tp0453、Tp92 在1998年的實驗中，有學者發現對于Tp92而言，其極有可能是Tp的抗原之一，并通過PET-3a T7載體重組表達了Tp92，通過對表達后的Tp92進行相應的檢測發現，Tp92確實具有抗原免疫性[9]。Tp0155、Tp0751、Tp0483、Tp0453都是通過PCR擴增法進行了去除N端信號肽的全長表達，且表達后的這6個蛋白均進行了臨床血清學的檢測，最后的實驗結果顯示，對于Tp0155、Tp0751、Tp0483而言，實驗的靈敏度為28%~42%之間，而對于Tp0453而言，其中檢測的靈敏度和特異度均為100%，Tp92的特異度為97%、靈敏度為98%。其中學者描述了Tp0453的除去兩段端肽的結構，但近些年來的實驗研究則顯示，Tp0453的結構目前與所有已知的外膜蛋白都不相同，Tp0453缺少一種β桶結構，正是因為缺少這種結構，導致Tp0453無法橫跨外膜，從而避免暴露于Tp的菌體外膜表面[10]。正是因為Tp0453的這種結構特殊性，有學者認為對于Tp0453極有可能代表一大類的新的細菌外膜蛋白。國內有學者新組了Tp0453并對其進行了臨床評價，最后的實驗結果顯示，Tp0453應該可以被用于ELISA反應[11]。

1.5 Tp4D以及TpN37 在1986年的國外學者的相應實驗中就已經證實，對于Tp4D而言，其確實具有抗原免疫性，同時相應的ELISA法也證實，4D的ELISA能夠檢測到的抗4D特異性抗體為25 ng，且在檢測的靈敏度上可以與免疫熒光法相媲美，但是Tp4D的一個重大缺陷就是存在著與地方性梅毒菌種的一個交叉反應[12]。同樣在1986年，國外學者使用5.6 kb的TpDNA的重組基因的質粒做出內切酶圖譜后，再成功地轉入大腸桿菌內進行了表達。利用免疫雜交點的方法對TpN37進行檢測時發現，對于梅毒二期的血清檢測有效，如果改變檢測的方法，利用放免和酶免的方法進行相應的檢驗，TpN37與所有血清中的抗體都能夠發生反應，但唯一的不足是對于陰性對照則沒有反應表現出。在兔梅毒模型中，利用兔子血清制作的特異性兔單克隆抗體能夠有效地被TpN37抗原，并且TpN37抗原不會與其他的非致病性的螺旋體發生反應，上述實驗結果提示對于TpN37而言，其能夠有效的作為血清診斷梅毒的有效抗原[13]。

2 梅毒螺旋體基因重組抗原血清學診斷的研究進展

有相應的臨床大樣本量的實驗研究證實，Tp凝血實驗的最終結果與利用Tp基因重組抗原的臨床快速檢測在檢測的靈敏度上無顯著統計學差異。但Tp單一基因重組抗原對于合并了HIV感染，或者是已經接受了一段時間的抗梅毒治療的患者，或者是處于潛伏期的梅毒患者而言，其檢測的靈敏度會大大下降，而如果使用多基因重組的Tp重組基因抗原，則其檢測的整體靈敏度將會大大提高，出現的假陰性的比例會大大減小[14]。

2.1 免疫層析實驗的研究進展 利用Tp基因重組的抗原包被膜條測試區時，當抗原中的IgG/IgM與膜條測試區域中的標記的抗人IgG/IgM結合后，結合后的復合物最終層析到膜條測試區與特異抗原結合后所呈現出來的顯色標記就為陽性反應標記[15]。在TPHA的評價標準下，有學者將4種不同國家生產的免疫層析試劑盒用來進行評價，結果這4個國家的免疫層析試劑盒的最終檢測結果顯示，不論是在全血還是在血清檢測的敏感性上，都取得了良好的結果，上述的實驗結果讓人相信在不遠的將來，免疫層析實驗將有可能取代傳統的篩查實驗。

2.2 Tp-ELISA的研究進展 在目前的Tp-ELISA研究中，聚苯乙烯反應板微孔在被Tp重組基因抗原包被，且抗人IgG/IgM在被酶標記的情況下，可以有效的對Tp的IgG/IgM進行檢測。在雙抗原夾心的ELISA法中，酶和反應板均對Tp重組的酶抗原進行了標記。在利用Tp的3種組合表達蛋白，TpN15、TpN17、TpN47的ELISA檢測實驗與性病研究實驗、熒光密螺旋體抗體吸收試驗以及TPHA實驗的檢測靈敏度、特異度相比，利用Tp的3種組合表達蛋白，TpN15、TpN17、TpN47的 ELISA檢 測 實 驗 的對處于不同分期的梅毒患者的檢測的靈敏度、特異度均要顯著高于其他3種方法。而國外學者在利用重組的TpN17-15-ELSIA法與WB、以及THBA法相比，在對正常人和含有疾病的2950份血清的檢測中，TpN17-15-ELSIA法與WB法均未出現交叉反應，而THBA法則出現了交叉反應[16]。而在對Tp多基因嵌合重組抗原與Tp單基因重組抗原的平行檢測中發現，Tp多基因嵌合重組抗原檢測的靈敏性要顯著高于Tp單基因重組抗原，在對雙抗原夾心ELISA法與間接ELISA法的比較中，雙抗原夾心ELISA法的檢測準確性要顯著優于間接ELISA法。而目前在投入商業化使用的Tp重組基因的ELSIA法檢測試劑盒中，其檢測的靈敏度和特異度均為100%。

2.3 快速乳膠凝集試驗 在實驗的原理上，快速乳膠凝集試驗的基本原理與Tp的顆粒凝集試驗相似。在臨床實驗中，有學者利用TpN15、TpN17、TpN47作做為抗原，利用快速乳膠凝集試驗法快速檢測了1518份隨機得來的血清樣本，將檢測的實驗結果同VDRL法的特異度進行檢測，并同時期檢測99分梅毒血清樣本，最后的實驗結果顯示，快速乳膠凝集試驗與VDRL法檢測的特異度并無顯著的統計學差異[17]。上述的實驗結果提示，在梅毒的篩查中可以考慮使用快速乳膠凝集試驗。

2.4 CLIA法 CLIA法的中文名稱為化學發光免疫分析，其基本原理為將固相抗原設定為Tp基因重組抗原，利用HRP對第二抗原進行標記，同時使用含魯米諾或者是其對應的增強劑作為示蹤劑，通過最后測量其發光數值的方法來進行檢測。我國學者通過使用TpN15、TpN17、TpN47作為對應的酶標抗原和固相抗原，成功的建立了基于Tp為雙抗原夾心的CLIA法，通過與TRUST、TPPA、TPHA、Tp-ELISA法 平 行 的 檢 測 Tp抗體檢測分別呈陽性和陰性的血清，結果最后的實驗結果顯示這4種方法的陽性檢測率和陰性檢測率均無顯著的統計學差異[18]。

2.5 WB法 將Tp的重組基因抗原通過SDS-PAGE通過電印轉印到PVDF膜上，再與待檢測的血清進行檢測后通過酶標記抗人的IgG/IgM。其實驗的基本原理為，如果待檢測的血清中存在TpN15、TpN17、TpN42、 TpN47、TpN37等抗體，則加酶的底物可以出現反應，并且能夠顯色。有國外學者將rpN47、rTpNl7、rTpNl5、rTpN42、rTpN37這5種多肽進行重組建立recWB法，并與MHA-Tp以及wclWB對比進行梅毒血清的檢測，相應的實驗結果顯示，在各項綜合指標的評價中，recWB法要顯著優于wclWB法[19]。

目前部分Tp重組基因的抗原已經應用于臨床梅毒的檢測中，其中涉及的Tp基因重組的抗原主要為TpN15、TpN17、TpN47，在初期使用的Tp基因重組抗原多為單一基因的抗原，現在則多為多基因嵌合的抗原，雖然對于各期梅毒的檢查靈敏度和特異度得到了極大的提高，但是仍然存在著較大的不足，且在實際中對于何種Tp抗原的檢測結果更為準確，仍然存在著較大的爭議[20]。目前隨著免疫學技術的不斷進步與發展，已經逐步能夠解決難以從Tp中純化的微量蛋白數量問題，并已經能夠對其具體的作用機制展開相應的研究。這也意味著，Tp基因重組抗原應用于梅毒的檢測中的前景更為廣闊。

[1]暴銀鳳，吳瓊杉，余銘恩.梅毒螺旋體多表位重組抗原的研制及其應用[J].中華檢驗醫學雜志，2011，34（3）：210-212.

[2]許美蓉，韋善求.梅毒螺旋體基因重組抗原研究及其臨床應用[J].右江民族醫學院學報，2013，35（1）：90-92.

[3]章剛，黃德新，駱曉棟.梅毒螺旋體重組抗原TpN47的純化工藝研究[J].中國藥業，2013，22（21）：4-5.

[4]劉小軍，牛淑會，蔡嘉怡，等.梅毒螺旋體重組蛋白Tp0608的表達與鑒定[J].中南醫學科學雜志，2013，41（4）：341-343，360.

[5] Sato N S， Suzuki T， Ueda T， et al. Gene cloning and expression of the Tp0453 antigen immuno-dominant epitope fragment of Treponema pallidum and its potential use in serodiagnosis of syphilis[J]. Chinese Journal of Infectious Diseases，2013，31（9）：524-528.

[6]王磊陽，陳政卓，富夢楚，等.梅毒螺旋體外膜蛋白Tp0136的制備及在血清學診斷中的應用[J].中國衛生檢驗雜志，2011，21（5）：1045-1047，1053.

[7] Li J， Zheng H Y， Wang L N， et al. Expression， purification and immunocompetence analysis of a Treponema pallidum recombinant protein TP0993[J]. Chinese Journal of Dermatology，2013，46（5）：305-308.

[8]龍福泉，王千秋，張津萍，等.梅毒螺旋體重組蛋白Tp0136的表達、純化及免疫活性分析[J].中華皮膚科雜志，2012，45（6）：396-399.

[9]曾鐵兵，裴瑞青，張躍軍，等.梅毒螺旋體Tp 0993重組蛋白的表達及鑒定[J].南華大學學報·醫學版，2010，38（5）：598-600.

[10]吳穎，曹景宏，唐玉霞，等.梅毒螺旋體重組蛋白rTpN37為抗原的ELISA的建立與RPR和TPPA血清學檢測效果的比較[J].中國衛生檢驗雜志，2010，20（10）：2491-2493.

[11]朱中元，張丹，王海波，等.結核分枝桿菌CFP-10與Rv2626c蛋白的表達及血清學診斷研究[J].中國人獸共患病學報，2012，28（12）：1212-1215.

[12]馬開富，劉勝武.梅毒血清學診斷實驗方法研究進展[J].國際檢驗醫學雜志，2012，33（1）：63-66.

[13]曹文芩，宋文忠，畢超.六種梅毒初篩試驗試劑的評價[J].國際檢驗醫學雜志，2010，31（2）：129-130.

[14]徐慧杰，徐杰前，候玨.梅毒抗體篩查可疑感染獻血員回訪結果分析[J].中國輸血雜志，2010，23（9）：724-725.

[15]李鄭紅，陸倫根.肝纖維化血清學診斷研究進展[J].國際消化雜志，2013，33（5）：295-297.

[16]席艷華，劉金濤.梅毒螺旋體的檢測方法和臨床應用及研究進展[J].國際檢驗醫學雜志，2011，32（20）：2375-2376.

[17]姜烜星，王濤，陳曉琴.1910例住院患者梅毒血清學檢測結果分析[J].中國臨床研究，2010，23（5）：40.

[18]方偉禎，謝文鋒，丁睿，等.300例住院患者梅毒血清學試驗陽性結果分析[J].中國實用醫藥，2011，6（3）：9-11.

[19]郭琦，陳秀芹，孫海斌，等.抗sTn抗體3P9和B72.3在子宮內膜癌血清學診斷中的對比研究[J].中南大學學報（醫學版），2013，38（11）：1117-1121.

[20] An Y， Han W， Chen X， et al. A novel anti-sTn monoclonal antibody 3P9 inhibits human xenografted colorectal carcinomas[J]. J Immunother，2013，36（1）：20-28.