小鼠腎臟中CD133表達的研究

劉 偉，馬云勝，穆長征，田 鶴

（遼寧醫學院組織學與胚胎學教研室，遼寧錦州121000）

腎臟損傷后可以再生，原因是由于在腎臟組織中存在一部分再生能力較強，具有一定自我更新能力的干細胞樣細胞成分。從目前的研究結果看，由于腎臟中細胞成分復雜，腎臟中有可能存在幾種干／祖細胞，因此其標志物亦可能根據不同的節段而不同。Bussolati等［1］發現從人腎臟中分離培養的CD133細胞具有較強的增殖能力，也可以分化為上皮或內皮細胞，修復小管損傷，因此這群細胞具有干細胞特性。本研究在小鼠腎臟原位檢測CD133細胞的表達與分布，從空間定位角度分析該細胞的位置及數量，為該細胞組織修復提供數據支持，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 選取昆明小鼠12只（遼寧醫學院實驗動物中心提供，清潔級，雌雄不限，35～30g，3月齡）；兔抗CD133（北京博奧森公司），DAB（武漢博士德公司）；HRP標記的羊抗兔IgG（北京中杉金橋公司）。

1.2 方法

1.2.1 腎臟組織的采集 取成熟健康昆明小鼠，左心室灌流固定后，取雙側腎臟，4%多聚甲醛固定24h后，梯度乙醇脫水，入二甲苯透明，60℃浸蠟3h，包埋制成石蠟塊。

1.2.2 切片制備與CD133免疫組織化學檢測 用Leca3215切片機將腎臟組織切成5μm厚度切片，黏附于涂有多聚賴氨酸的防脫片上，60℃烤片2h后，切片二甲苯脫蠟2h，梯度乙醇下行入水。3%過氧化氫清除內源性過氧化物酶5min，枸櫞酸鹽緩沖液高壓鍋法進行抗原修復。自然冷卻后，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗3次，每次5min，組畫筆畫圈，5%BSA封閉10min室溫下滴加兔抗CD133（1∶200）抗體。濕盒內4℃冰箱過夜。次日取出去除一抗，PBS洗3次，滴加HRP標記的羊抗兔IgG，室溫孵育1h，PBS洗3次，DAB顯色并觀察，適時終止顯示，清水沖洗，蘇木精復染細胞核，梯度乙醇脫水，樹膠封片。

1.2.3 免疫蛋白印跡法（Western blot）檢測CD133表達 取整個腎臟，眼科剪剪碎，加1mL蛋白裂解液，超聲波使細胞充分裂解，然后分別轉移到1.5mL的離心管中，置于冰中30 min，然后4℃下12 000r／min離心40min，取總蛋白每孔30 μg，100 ℃ 煮 沸 10min，10% 聚 丙 烯 酰 胺 凝 膠 電 泳 （SPSPAGE）分離總蛋白，然后將蛋白轉移至聚偏氟乙烯（PDVF）膜上，用5%脫脂奶粉封閉2h，一抗（兔抗CD133，1∶500）4℃孵育過夜，次日加二抗（1∶1 500）孵育2h，ECL顯色。

1.3 統計學處理 Western blot結果采用系統自帶軟件對目的條帶進行光密度值的分析。采用SPSS13.0統計軟件進行分析，采用單因素方差分析比較樣本均數，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 免疫組織化學結果 CD133陽性細胞分布于腎臟的皮質和髓質（圖1）。在皮質區域，CD133表達于一小部分遠端小管上皮細胞的頂端（圖1a），散在分布，注意CD133都表達在靠近腎小體血管極的遠端小管曲部上。偶爾在細胞質里也可見到陽性表達（圖1b）。甚至有少量CD133細胞表達在小管上皮細胞的側面和整個小管的周圍。在髓質和腎乳頭區域CD133表達于升支粗段，細段和集合管（圖1c）。在內髓CD133分布的較外髓內帶要廣泛，并且以一小群細胞或單個細胞表達形式存在（圖1d～f）。

圖1 小鼠腎臟中CD133的免疫組織化學結果

2.2 Western blot檢測結果 Western blot檢測提示小鼠腎臟組織中均檢測到CD133表達，在120×103左右出現特異性結合條帶，見圖2。

圖2 小鼠腎臟組織CD133Western blot結果

3 討 論

腎臟中組織成分復雜，其損失后修復的機制可能有多種。腎小管上皮細胞具有一定的更新能力，這說明腎小管上皮必然存在具有干細胞屬性的細胞成分。而在很多疾病導致的腎臟小管上皮細胞壞死等都依賴于腎小管上皮細胞的修復和再生，以重新恢復其營養重新收及水代謝功能。CD133被認為是腫瘤細胞標志物，在某些腫瘤如腎透明細胞癌中呈大量陽性表達。CD133也可以被認為是一群干／祖細胞標志物，CD133抗原早期用于從造血組織和神經組織中分離干細胞，在造血組織中CD133只表達于CD34陽性干細胞和祖細胞上［2］。此外，在骨骼肌和神經組織中也存在一部分CD133陽性細胞［3］。Osafune等［4］從腎臟細胞中分離的CD133細胞不表達CD34和CD45，這說明在不同的組織中表達CD133細胞是不同的。Bruno等［5］在體外研究發現該細胞具有自我更新和復制的能力。此外從形態上看CD133細胞具有明顯的極性，這說明他們具有分化細胞的特征。體外研究表明，CD133細胞具有較強的擴增能力，標記后的CD133細胞靜脈注射到SCID小鼠后，該細胞在腎小管并修復了腎小管損傷，從而修復腎臟損傷［6－7］。

本研究發現，在成年小鼠的腎臟內髓，腎乳頭區集合管，細段，廣泛分布著CD133陽性細胞。而在皮質和外髓區CD133陽性細胞的數量較少，僅限于髓放線集合管和腎單位區髓袢升支細段和遠曲小管，皮質集合管則沒有分布。Lazzeri等［8］應用Brud標記法發現腎乳頭區細胞增殖能力強，表現為大量的標記細胞出現，并認為該區為腎臟干細胞的定居點［8］，本研究發現，CD133分布在內髓腎乳頭區較多，少量分布于外髓的集合管和腎單位遠端小管。作者的發現進一步印證了O′Neill等［9］的觀點，該觀察可以為對于腎臟損傷修復的細胞分布的空間位置關系提供形態學依據，同時本研究也可能解釋遠端小管修復機制，下一步實驗應該研究在腎臟損傷疾病模型上CD133的表達情況，進一步揭示腎臟損傷及修復的機制。總之，腎臟中干細胞表達CD133，本實驗從原位尋找CD133表達位置，為腎臟干細胞提供空間表達數據。

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