20株鮑曼不動(dòng)桿菌碳青霉烯酶耐藥基因分析及同源性研究

楊銀忠，趙 鵑，丁少川，程文霞，孫熙奉

（1.四川省人民醫(yī)院城東病區(qū)檢驗(yàn)科，成都610101；2.成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)療技術(shù)學(xué)院，成都610075）

鮑曼不動(dòng)桿菌（acinetobacter baumanmii，AB）廣泛存在健康人體的皮膚、口腔、呼吸道、胃腸道和泌尿道，也廣泛分布在自然界和醫(yī)院環(huán)境，該菌毒力低，為條件致病菌。但近年來，隨著抗菌藥物的廣泛使用，多重耐藥（multidrug－resistant，MDR）AB的出現(xiàn)，特別是AB的碳青霉烯酶出現(xiàn)，使得預(yù)防和臨床治療帶來極大挑戰(zhàn)，檢測其耐藥基因型別及同源性顯得尤其重要。本文分析了四川省人民醫(yī)院臨床分離的耐碳青霉烯類抗菌藥物AB的分子耐藥機(jī)制，及來自ICU的AB菌株的同源性情況，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 收集四川省人民醫(yī)院2011年2～6月從患者呼吸道分離的AB 20株，其中9株來自呼吸科、血液科、心內(nèi)科、神內(nèi)科及消化科，4株來自肝膽外科、創(chuàng)傷外科及普外科，7株來自ICU。標(biāo)本類型包括痰液及咽拭子等；培養(yǎng)及分離嚴(yán)格按《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》（第3版）進(jìn)行。

1.2 儀器與試劑 API及配套試劑、ATB藥敏試劑、REPPCR DNA指紋圖譜試劑、PCR指紋試劑（DiversiLab不動(dòng)桿菌試劑盒）及 Microfluidics芯片和反應(yīng)試劑均購自法國Biomerieux公司；PTC－200PCR擴(kuò)增儀、Gel Doc XR＋凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國Bio－Rad公司；Agilent2100分析儀購自美國Agilent Technologies公司；PCR反應(yīng)體系和DNA marker DM2000（北京康為試劑生物科技公司）。

1.3 AB鑒定及藥物敏感實(shí)驗(yàn)

1.3.1 AB生物學(xué)鑒定 用API20E和API20NE兩種試劑嚴(yán)格按照試劑說明書操作，以及補(bǔ)充試驗(yàn)42℃生長試驗(yàn)進(jìn)行細(xì)菌鑒定，質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC（25922）和銅綠假單胞菌 ATCC（27853）。

1.3.2 AB基因?qū)W鑒定 由于OXA－51天然存在于AB中，利用OXA－51成功鑒定出AB，并指出這是鑒定AB最簡單、可靠的方法［1］；設(shè)計(jì) OXA－51基因引物，上游 5′－TAA TGC TTT GAT CGG CCT TG－3′，下游：5′－TGG ATT GCA CTT CAT CTT GG－3′，經(jīng)過提取、擴(kuò)增、變性、退火及延伸后，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并由凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行成像。

1.3.3 AB藥物敏感實(shí)驗(yàn) 采用MIC法，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，藥敏結(jié)果判斷和解釋參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）2009年抗菌藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，質(zhì)控菌株同生物學(xué)鑒定，最后用WHONET5.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4 PCR檢測碳青霉烯酶耐藥基因 碳青霉烯酶耐藥基因引物序列設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)［1］。用煮沸法提取模板DNA；靶基因PCR擴(kuò)增體通過提取、擴(kuò)增、變性、退火及延伸等共30個(gè)循環(huán)，再將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行10g／L瓊脂糖凝膠電泳，最后凝膠成像分析系統(tǒng)成像；選取陽性基因擴(kuò)增產(chǎn)物純化并測序（由Invitrogen公司完成）。

1.5 同源性分析

1.5.1 REP－PCR技術(shù) 采用DNA芯片加入配制的凝膠混合物和重復(fù)序列聚合酶鏈反應(yīng)（REP－PCR）產(chǎn)物后，加載于Agilent2100生物分析儀上進(jìn)行自動(dòng)化的凝膠分析和數(shù)據(jù)處理分析。

1.5.2 Agilent2100的DiversiLab分析 具體操作參見“Agilent DNA Guide”；最后Agilent 2100生物分析儀自帶軟件可自動(dòng)生成樹狀圖和虛擬凝膠圖等。

1.5.3 檢測原理 REP－PCR引物與許多分布在整個(gè)基因組上的、特異性的重復(fù)序列配對，從而產(chǎn)生各種片段大小的擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增片段通過微流芯片試劑盒對片斷進(jìn)行電泳分離及檢測，DiversiLab系統(tǒng)收集并分析數(shù)據(jù)，同時(shí)產(chǎn)生相應(yīng)的峰值圖，不同峰值代表不同大小DNA片段，從而對細(xì)菌的DNA進(jìn)行同源性分析。

1.5.4 結(jié)果分析 應(yīng)根據(jù)細(xì)菌DNA指紋圖譜條帶、峰的位置、數(shù)目和豐度等因素判斷菌株的同源性；菌株間的相似性大于95%，劃分為同一克隆組；菌株間的相似性大于97%，劃分為同一亞克隆組；菌株間的相似性小于95%，則劃分為不同克隆。

2 結(jié) 果

2.1 AB鑒定結(jié)果

2.1.1 AB生物學(xué)鑒定 采用API20E及20NE兩種不同的試劑條進(jìn)行鑒定，其鑒定代碼分別為020404203和0041073，42℃生長試驗(yàn)：生長，結(jié)果為：鮑曼不動(dòng)桿菌。

2.1.2 AB基因?qū)W鑒定 20株AB均檢出攜帶OXA－51基因（圖1），其產(chǎn)物長度約為353bp；經(jīng)PCR產(chǎn)物測序比對分析顯示與目標(biāo)基因AB（HQ222987.1）完全相符，其結(jié)果為：鮑曼不動(dòng)桿菌。

圖1 OXA－51耐藥基因PCR電泳圖

2.2 AB藥物敏感實(shí)驗(yàn)結(jié)果 20株AB均表現(xiàn)為對亞胺培南及美洛培南耐藥且為MDR；其中對阿米卡星、奈替米星、妥布霉素、復(fù)方新諾明耐藥率為88.9%～94.4%，其余耐藥率為100.0%，用WHONET5.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，見表1。

表1 AB藥物敏感實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.3 PCR檢測結(jié)果

2.3.1 PCR檢測碳青霉烯酶耐藥基因結(jié)果 見表2。

表2 菌株耐藥基因檢測結(jié)果

續(xù)表2 菌株耐藥基因檢測結(jié)果

2.3.2 20株AB的OXA－23耐藥基因PCR電泳圖 見圖2。

圖2 OXA－23耐藥基因PCR電泳圖

2.4 同源性分析 采用DiversiLab系統(tǒng)將7株AB分為2個(gè)親緣性不同的克隆組：克隆組1包括6株AB，同時(shí)分為親緣性相近的2個(gè)亞克隆組，每個(gè)亞克隆組內(nèi)菌株為同源株；克隆組2有1株AB；不同克隆組的AB耐藥表型不同，同一克隆組的不同亞克隆AB其耐藥性也存在差異，見圖3～5。

圖3 菌株REP－PCR電泳檢測結(jié)果

圖4 菌株克隆組及亞克隆組結(jié)果

圖5 菌株DiversiLab同源性分析結(jié)果

3 討 論

碳青霉烯類抗菌藥物對AB有較好的抗菌活性，是治療MDR AB感染的重要抗菌藥物之一，因?yàn)樵谒笑拢瓋?nèi)酰胺類藥物中，碳青霉烯類藥物抗菌譜最廣，抗菌活性最強(qiáng)，其對革蘭陰性菌產(chǎn)生的超廣譜β－內(nèi)酰胺酶、AmpC酶具有較高穩(wěn)定性。但近年來，然而隨著碳青霉烯類藥物的廣泛使用，AB對碳青霉烯類的敏感性也在逐年下降，其耐藥菌引起的醫(yī)院感染暴發(fā)流行已成為日益嚴(yán)重的醫(yī)療事件和公共衛(wèi)生問題。本研究表明，20株AB均耐碳青霉烯類抗菌藥物且均為多重耐藥株，表明該地區(qū)多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，與國內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道基本一致［1－3］。因此，應(yīng)首先加強(qiáng)抗菌藥物的管理及使用，其次要做好耐藥菌的主動(dòng)篩查以及定值、感染患者的及時(shí)隔離，以防止醫(yī)院感染的發(fā)生。

AB對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥機(jī)制非常復(fù)雜，可能與外膜孔蛋白的丟失，外排泵的激活，青霉素結(jié)合蛋白的改變等有關(guān)，而最重要的是碳青霉烯酶的產(chǎn)生［4－7］。該酶是指能水解碳青霉烯類抗菌藥物的β－內(nèi)酰胺酶，依據(jù)Ambler分子可將其分為3類：A、B、D類酶，在多重耐藥的AB中主要發(fā)現(xiàn)的是B、D類酶。B類是金屬酶，包括IMP、VIM和SIM等，水解底物范圍廣，包括除氨曲南以外的所有β－內(nèi)酰胺類抗菌藥物，但本研究未檢測到該酶。D類酶是苯唑西林酶，對碳青霉烯類抗菌藥物的水解活性較低，對其耐藥性的介導(dǎo)常合并外膜通透性的降低和（或）外排泵的過度表達(dá)，但最近發(fā)現(xiàn)OXA－23基因上游存在ISAbal，由于插入序列ISAbal與OXA類碳青霉烯酶編碼基因的同源重組以及表達(dá)調(diào)控有關(guān)，ISAbal可以明顯增強(qiáng)OXA－23的表達(dá)，從而導(dǎo)致對碳青霉烯類抗菌藥物高度耐藥［5－12］。D類酶又可分4組，第1組即 OXA－23類，包括 OXA－23、27、49，同源性為99%；第2組為 OXA－24，包括 OXA－25、26、40，同源性為98%；第3組為 OXA－51類，包括 OXA－51、66、69是天然產(chǎn)生的，第4組為OXA－58，與其他3組的同源性為50%；OXA－51型碳青霉烯酶于2004年Brown等［13］首次在AB中發(fā)現(xiàn)，隨后研究表明blaOXA－51－likee基因?yàn)锳B固有的基因型，在敏感與耐藥株中均存在。最早報(bào)道OXA－23基因的是ARI－1，1985年在英國發(fā)現(xiàn)，后來在其他國家均有報(bào)道［13］，其PI 6.7由質(zhì)粒介導(dǎo)，1999年經(jīng)測序后命名為OXA－23。本研究顯示，20株檢均測到OXA－51碳青霉烯酶基因，16株檢測到OXA－23碳青霉烯酶基因，表明OXA－23基因是本院AB的主要耐藥基因。

國內(nèi)外報(bào)道了產(chǎn)OXA－23型碳青霉烯酶AB導(dǎo)致院內(nèi)感染暴發(fā)的事件［8－11，14］，說明目前世界上的 AB引起的醫(yī)院感染均以O(shè)XA－23型碳青霉烯酶為主，與本院的研究結(jié)果一致。

ICU是AB分離率最高的科室之一，一是由于激素、免疫抑制劑以及預(yù)防性大量抗菌藥物使用；二是各種侵襲性操作，在一定程度上造成了AB定植、擴(kuò)散，也誘導(dǎo)了耐藥菌的產(chǎn)生，給臨床的治療帶來了困難［15］。目前臨床缺乏有效治療AB的藥物，醫(yī)務(wù)工作者及感控人員應(yīng)采取積極有效措施，預(yù)防和控制AB感染。

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