乳腺癌術后骨轉移患者血清差異蛋白的質譜分析＊

張 朋，錫林寶勒日，白靖平，江仁兵，陳勇忠，黃 哲，李 星

（1.南京軍區福州總院四七六醫院骨科，福州350000；2.新疆醫科大學附屬腫瘤醫院骨與軟組織腫瘤科，烏魯木齊830011；3.凡星博奧北京科技有限公司，北京100080）

術后腫瘤復發和轉移是乳腺癌患者死亡的主要原因，其中骨轉移的發生率為65%～75%，首發癥狀為骨轉移的患者占27%～50%［1－2］。乳癌患者一旦發生骨轉移，5年生存率僅為20%，并且還可引起一系列的并發癥，比如骨痛、骨損傷以及骨相關事件（SEEs）［1］，是目前臨床上降低乳腺癌患者生活質量和影響患者生存的重要因素。本研究采用Clinprot液體芯片飛行時間質譜系統（ClinprotTMMALDI－TOF MS）分析并篩選乳腺癌術后骨轉移與無轉移患者的血清差異蛋白，為尋找乳腺癌骨轉移相關的血清標志物提供實驗依據，同時為進一步闡明乳癌骨轉移的分子機制以及開發逆轉骨轉移的靶向藥物提供理論研究基礎，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2009年2月至2010年10月在新疆醫科大學附屬腫瘤醫院住院復查的女性乳腺癌改良根治術后患者36例，術后病理組織學診斷均為乳腺浸潤性導管癌。分組：（1）乳腺癌改良根治術術后單純骨轉移（M組）共18例。其中原發乳癌分期Ⅱ期6例，Ⅲ期12例。年齡37～77歲，平均（52.72±11.89）歲；術后至骨轉移時間為9～122個月，平均33.7個月；所有患者均已行足療程化療，其中5例ER（＋）、PR（＋），9例ER／PR（＋）均行內分泌治療。入組者均經ECT及局部CT、MRI 3項檢查診斷，其中4例因椎體破壞疼痛劇烈行經皮穿刺椎體成形術，術后病灶組織病理結果支持診斷；且經B超等相關檢查未發現重要臟器轉移。抽血時間為診斷次日晨。（2）乳腺癌改良根治術術后無轉移組（S組），共18例。組織學病理分期及術后時間均與M組相匹配的患者，年齡34～74歲，平均（52.89±12.37）歲；所有患者均已行足療程化療，其中6例ER（＋）、PR（＋），9例ER／PR（＋）均行內分泌治療。入組者均經骨放射性核素掃描（ECT）檢查未見明顯異常；B超等相關檢查未發現重要臟器轉移。兩組患者年齡等一般資料差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性，本研究經患者知情同意和并經新疆醫科大學倫理委員會通過。

1.2 主要試劑與儀器 丙酮、乙腈、乙醇、醋酸銨（NH4Ac）、Peptide Calibration Standard、Protein Calibration StandardⅠ、弱陽離子交換磁珠（MB－WCX）、三氟乙酸（TFA）、Tris－HCL等均購自Sigma公司；MALDI－TOF－MS質譜儀及配套的Clin－ProTools分析軟件購自Bruker Daltonik公司。

1.3 方法

1.3.1 標本采集及處理 空腹抽取36例患者全血3mL，室溫下靜置1h，3 000r／min離心5min，取上清液加入對應標號的冷凍管中，每20μL一管分裝，－80℃保存。

1.3.3 試驗方法

1.3.3.1 弱陽離子磁珠（MB－WCX）的處理 （1）取10μL磁珠和10μL磁珠結合緩沖液（BB），混勻；（2）加入5μL血清，吹打混均；（3）置于磁珠分離器，靜置1min，移去上清液；（4）加入100μL磁珠清洗緩沖液（WB），靜置1min，移去上清液；（5）重復步驟（4）2次；（6）加入5μL磁珠洗脫緩沖液（EB），混勻；靜置2min，將洗脫液移入樣品管；（7）向洗脫液中加入5μL磁珠穩定緩沖液（SB）混勻，－20℃保存至質譜分析。

1.3.3.2 標準血清質控 標準血清經磁珠處理得到洗脫液，用質譜采集數據，每批數據采集完畢，與數據庫已有對應的相同磁珠相同采集方法的標準血清數據比較，變異系數（CV）＜30%。

1.3.3.3 樣品點靶 取5μL的0.4mg／mL HCCA基質，加入1μL的樣品洗脫液，吹打混勻；取1μL上述混合液體，點在600μm Anchorchip上，室溫干燥。

1.3.3.4 樣品譜圖的生成 采用Clinprot液體芯片飛行時間質譜系統獲取兩組患者血清肽質量指定圖譜（PMF）。（1）在Clinprot Standard校正方法下，對累加標準品圖譜進行校正，平均分子質量偏差應小于100ppm。（2）將樣品靶板放入Microflex質譜儀，設定采集范圍：（1～20）×103Da，激光能量：采用高激光能量轟一下結晶點8shots，再用低于高激光能量10%～20%的能量采集50shots；（3）同一樣品同一結晶點，調整采集點，累加8個點的數據（400shots）。保存累加的PMF。

1.4 統計學處理 采用ClinProTools軟件分析前先對樣品原始質譜圖進行處理，然后選擇軟件內嵌的統計算法對數據進行統計學分析，獲得兩組血清的差異表達蛋白，計量資料以x±s表示，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 質譜檢測的重復性驗證 試驗前將所有標本分成2份，5 d后重復檢測，試劑材料、方法步驟同前。結果顯示兩次PMF基本一致，隨機選擇4個蛋白峰計算CV均小于30%，該系統具有良好的可重復性，見圖1、2。

2.2 蛋白質譜分析 采用Biomarker Wizard軟件進行數據分析，未檢測到有統計學意義的蛋白質峰譜差異，未能建立診斷模型，見表1。

續表1 蛋白質譜統計學分析

圖1 M組2次重復試驗的PMF

圖2 S組2次重復試驗的PMF

2.3 對差異最顯著的M8063.25Da和M9772.81Da進行分析

在M組各個樣品譜圖中M8063.25Da和M9772.81Da的豐度大部分低于S組。平均圖譜中M組的M8063.25Da和M9772.81Da蛋白峰明顯低于S組，但差異無統計學意義（P＞0.05），見圖3～5。

圖3 兩組樣本中M8063.25Da和M9772.81Da的質譜堆積圖

表1 蛋白質譜統計學分析

圖4 兩組樣本中M8063.25Da和M9772.81Da的平均質譜圖

圖5 兩組樣本中M8063.25Da和M9772.81Da的平均值標準差比較圖

3 討 論

ClinprotTM液體芯片飛行時間質譜系統由功能磁珠、基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（MALDI－TOF－MS）、ANCHORCHIP技術和ClinProTools的生物信息學方法組成，已廣泛應用于腫瘤標志物的篩選、鑒定和疾病診斷模型的建立，如口腔癌［3］、卵巢癌［4］、腎細胞癌［5］、肺癌［6］、食管癌［7］、胃癌［8］、胰腺癌［9］、頭頸部惡性腫瘤［10］等疾病，并獲得了令人滿意的效果。

本研究采用Clinprot系統獲得乳腺癌術后骨轉移與無轉移患者血清PMF，發現兩組血清蛋白的表達在一定程度上存在差異，但差異無統計學意義（P＞0.05）。

本研究沒有檢測到兩組間的差異蛋白，未能建立乳腺癌骨轉移的診斷模型。分析其原因可能為：（1）骨髓微轉移（BMM）的影響。BMM理論：乳腺癌是一種全身性疾病，腫瘤細胞在早期就經血流播散出現遠處轉移，即便原發腫瘤被切除，隱匿在體內的微小轉移癌灶仍繼續發展。患者常無任何臨床表現，常規影像學檢查及常規病理檢查均難以發現。Slade等［11］對23例原發性乳腺癌外周血及骨髓進行微轉移檢測，外周血陽性率為13%，骨髓檢出率為61%。提示在乳腺癌BMM的診斷中，外周血的檢出率明顯低于骨髓檢出率，外周血檢測不能替代骨髓檢測。之后，Slade等［12］報道應用定量PCR及免疫組織化學檢查外周血細胞角蛋白19（CK－19）發現，手術前51%患者存在BMM。收集的91例標本中，采用定量PCR、免疫組織化學分別發現87%和65%的患者在隨訪期間出現BMM現象。因本研究患者均由CT、MRI或ECT等常規檢查確定診斷，不排除BMM對試驗結果的影響。（2）全身化療的影響。化療可減少或消滅微轉移灶，抑制微轉移灶的擴展，減少生長刺激因子的釋放，減少甚至殺滅腫瘤細胞。國內外均有試驗證實乳腺癌患者化療后外周血微轉移因子水平明顯下降。Manhani等［13］利用 RT－PCR檢測乳腺癌患者 CK－19，陽性率由化療前的43.0%降至14.3%（3周期化療）和18.9%（6周期化療）。Zheng等［14］采用巢式RT－PCR方法檢測乳腺癌患者外周血中泌乳素誘導蛋白（PIP）mRNA的表達變化發現，PIP表達陽性的患者中有76.5%化療后轉為陰性。Zhang等［15］經半定量 RT－PCR檢測乳腺癌患者 CK－20mRNA，化療后31.8%轉為陰性，47.7%表達明顯下降。本研究中兩組患者均已接受化療，均可能對試驗結果產生一定影響。（3）內分泌治療的影響。乳腺癌的發生與雌激素的水平有關，內分泌治療可改變激素依賴性腫瘤生長所需的內分泌微環境，使腫瘤細胞增殖停滯于G0或G1期，從而抑制腫瘤細胞的生長、增殖。兩組中均有部分患者接受內分泌治療，不排除治療對試驗結果的影響。（4）由于研究經費及時間限制，有限的血清樣品只重復檢測了2次。

綜上所述，乳腺浸潤性導管癌改良根治術后單純骨轉移與無轉移患者不存在血清差異蛋白，不能通過檢測外周血的方法篩選乳腺癌骨轉移差異蛋白。通過上述研究，為筆者下一步加入骨髓進行對照檢測，增加樣本量及重復檢測次數奠定了基礎。筆者希望能夠篩選出敏感性高、特異性強的腫瘤標志物，最終能廣泛應用于乳腺癌骨轉移的篩查。

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