縮宮素對大鼠心肌缺血再灌注后一氧化氮及內皮素－1的影響

牛少輝，張麗華，劉旭邦，陳 杰

（鄭州大學第二附屬醫(yī)院心血管內科，鄭州450014）

對缺血心肌施行再灌注治療是缺血性心臟病的主要治療方法之一，缺血再灌注在拯救缺血心肌的同時還會造成心肌的缺血再灌注損傷（ischemic／reperfusion，I／R），加重單純心肌缺血所造成的損傷，成為影響療效的一個重要因素。目前研究發(fā)現，與女性生殖相關的催產素（oxytocin，OT）在心血管系統(tǒng)中也起著新的作用，同時在大鼠、人類的心臟以及血管床中已經發(fā)現了有功能的OT受體［1］。多項研究也表明，I／R與一氧化氮（NO）、內皮素－1（ET－1）有密切關系。但是，OT保護心肌防治I／R機制還未明確。本實驗通過建立大鼠心臟I／R模型，觀察OT對I／R心肌組織中NO、ET－1表達的影響，探討其對心肌I／R的保護作用機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康成年雄性SD大鼠，體質量250～300g（鄭州大學實驗動物中心提供，批號：410118）。OT注射液每支1mL（上海典微生物技術有限公司，批號：H34022979）。實驗儀器：Hx－100E小動物呼吸機（自成都豢肇科技公司）。

1.2 大鼠心肌I／R模型制作及分組 取雄性SD大鼠80只，分為I／R組、I／R＋OT組、假手術組（SH組）和健康對照組（N組），每組20只。4組大鼠適應性喂養(yǎng)1周，術前12h禁食。SH組、I／R組和I／R＋OT組用質量分數為10%的水合氯醛（0.3mL／100g）腹腔麻醉后固定于操作臺，胸部去毛，消毒，氣管切開，機械輔助通氣，沿胸骨左緣開胸，暴露心臟，環(huán)繞左冠狀動脈前降支根部穿線，結扎，以鹽水紗布覆蓋，25min后剪開結扎線，使心肌再灌注，120min后結束實驗。線結扎左冠狀動脈前降支致心肌缺血，去除結扎線致心肌再灌注，僅穿線而未結扎者為SH模型。以心電圖和心肌顏色改變作為缺血再灌注造模成功的標志：結扎左冠狀動脈前降支后見心電圖ST段立即抬高，局部心肌顏色由紅變灰；再灌注時抬高的ST段回落50%以上，心肌顏色變紅。I／R＋OT組大鼠于術前25 min腹腔注射縮宮素0.03μg／kg，其余3組分別給予相同劑量生理鹽水腹腔注射［2］。

1.3 指標測定 再灌注結束后，取大鼠腹主動脈血4mL，靜置60min后，3 000r／min，離心5min，吸取上層血清，保存在－70℃的冰箱中。分別以化學法和放射免疫法測定血清NO、血漿ET－1值，并計算NO／ET－1比值；全自動生化分析儀檢測血清肌酸激酶同工酶（CK－MB）、乳酸脫氫酶（LDH）。所有操作均按照試劑盒說明進行操作。

1.4 組織形態(tài)分析 再灌注結束后，將大鼠頸椎脫臼處死，48 h內取左心室前壁心肌梗死區(qū)為標本。在10%甲醛溶液中固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，6μm連續(xù)切片，分別做HE染色、顯微鏡檢查。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以表示，組間 NO、ET－1、CK－MB和LDH 水平采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD－t法；相關分析采用Pearson分析，檢驗水準α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 HE染色結果 SH組和N組心肌切片中，可見心肌纖維排列整齊，有分支，細胞核染色清晰，核位于肌纖維中軸部分，未見細胞變性和壞死。I／R組心肌纖維排列不規(guī)則，心肌纖維水腫、斷裂，肌漿內空泡形成，肌漿溶解，心肌間質水腫，較多粒細胞灶狀浸潤，及見小灶性出血，I／R＋OT組可見心肌細胞排列、間質水腫及粒細胞浸潤程度介于N組與SH組，見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織結構變化（HE×400）

2.2 血清 CK－MB、LDH 的變化 與SH 組相比，I／R組和I／R＋OT組血清中心肌酶CK－MB、LDH均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而N組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；I／R＋OT組血清中心肌酶CK－MB、LDH水平較I／R組低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 OT對大鼠心肌I／R后CK－MB、LDH的影響±s，U／L）

表1 OT對大鼠心肌I／R后CK－MB、LDH的影響±s，U／L）

＃：P＜0.05，與SH組比較；＊：P＜0.05，與I／R組比較。

CK－MB LDH SH組 20 174.6±65.3＊ 935.5±245.7組別 n＊N組 20 141.2±73.4＊ 824.9±197.5＊I／R組 20 2 368.4±605.1＃ 2 047.2±421.4＃I／R＋OT組 20 1 523.7±387.9＃＊ 1 499.7±405.8＃＊

2.3 血清 NO和ET－1的變化 與SH 組相比，I／R組和I／R＋OT組血清中NO水平均降低、ET－1水平均升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而在N組的表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；給予OT干預后均可明顯增加NO水平，降低ET－1水平與I／R組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 OT對大鼠心肌I／R后NO和ET－1的影響±s）

表2 OT對大鼠心肌I／R后NO和ET－1的影響±s）

＃：P＜0.05，與SH組比較；＊：P＜0.05，與I／R組比較。

組別 n NO（μmol／L） ET－1（pg／mL）SH組 20 40.7±6.1＊ 83.32±12.47＊N組 20 56.8±3.4＊ 68.54±17.2＊I／R組 20 19.9±3.8＃ 187.29±41.51＃I／R＋OT組 20 36.7±3.4＃＊ 141.71±25.84＃＊

2.4 相關性分析 對各組NO、ET－1水平分別用SPSS繪圖功能做散點圖，并進行Pearson相關性分析：I／R組NO、ET－1水平呈負相關（r＝－0.762，P＜0.05）；I／R＋OT組 NO、ET－1水平呈負相關（r＝－0.607，P＜0.05）。N組和SH組無明顯相關性。

3 討 論

有研究發(fā)現，除了下丘腦和大腦的其他部位，心臟也可以合成和釋放OT，應用放射免疫分析法可以在心臟的4個腔室中檢測到OT的存在。同時，在心房、心室和血管內皮細胞中都發(fā)現了OT受體［1］。Gutkowska等［2］研究表示，OT是一種心血管激素，通過誘導ANP的釋放對心血管有重要作用。Dusunceli等［3］研究發(fā)現，在大鼠肝臟的缺血再灌注中，OT可以刺激NO的釋放，保護缺血組織。Tugtepe等［4］研究證實，在大鼠腎臟I／R模型中OT也可以刺激NO的釋放，保護腎功能［5］。在 OT對心肌I／R損傷的研究中，Alizadeh等［5］發(fā)現，在心肌細胞中OT通過激活的線粒體KATP通路對心肌起保護作用，但是OT與心肌缺血再灌注密切相關的NO、ET－1的關系還未報道。

內皮源性NO是內皮細胞產生的舒張血管的強大物質，多數研究表明，在急性心肌缺血再灌注時，心肌發(fā)生不同程度的心肌損傷，這與血漿NO含量下降有關［6－7］。在缺血再灌注預處理過程中，NO對缺血再灌注損傷具有調節(jié)和保護作用。Wink等［8］實驗表明，NO具有抗氧化作用，它把培養(yǎng)的肺成纖維細胞及神經元暴露于過氧化生成體系中，發(fā)現細胞損傷存在劑量依賴性；而在其中加入NO供體后，細胞損傷顯著減輕。心肌再灌注伴過氧化物的大量產生，因而提前加入NO供體有利于細胞的保護。ET是一種強大的縮血管物質，具有收縮冠狀血管、降低心率等作用。目前發(fā)現人的ET有3種，主要由血管內皮細胞產生，其中ET－1的生物活性最強，收縮血管的作用最為強烈。心肌缺血再灌注可以導致ET數量增加，尤其在灌注期增加的更加迅猛，有可能是缺血再灌注導致內皮細胞穩(wěn)態(tài)失衡的結果，研究發(fā)現，ET轉換酶抑制劑PP36可以保護急性心肌缺血大鼠的心功能［9］。正常情況下，血管內皮釋放一定量的 NO、ET－1，NO舒張血管，ET－1收縮血管，二者的動態(tài)平衡調節(jié)著血管的舒縮［10－11］。心肌缺血缺氧，內皮功能障礙，對周圍環(huán)境的反應性減弱，NO的釋放量減少和生物活性下降，NO和ET對血管的效應相反，是相互拮抗的關系，NO釋放減少，收縮血管的ET－1釋放水平就會急劇上升，NO／ET－1失調，二者的平衡被破壞，這些原因導致冠狀動脈收縮，血流減少，流速減慢，中性粒細胞在內皮細胞上聚集，釋放各種介質和氧自由基，心肌缺血缺氧加劇［12］。

本實驗結果顯示，I／R組CK－MB、LDH及光鏡下心肌組織的改變，均反映心肌缺血壞死較重，提示造模成功；I／R＋OT組CK－MB、LDH水平明顯下降，光鏡下心肌組織改變較I／R組輕，提示OT可能對心肌I／R損傷有保護作用。與SH組相比，I／R組和I／R＋OT組血清中 NO水平均降低、ET－1水平均升高（P＜0.05），而在N組的表達差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；血清中NO降低的水平、ET－1升高的水平在I／R組較I／R＋OT組高（P＜0.05）；NO、ET－1的表達水平呈負相關。提示心肌I／R后NO水平降低、ET－1水平升高，可能是導致心肌損傷的重要病理生理機制，機制可能是血管收縮，血流減少，流速減慢，中性粒細胞在內皮細胞上聚集，釋放各種介質和氧自由基，進而損傷心肌。I／R＋OT組血清中NO水平較I／R組高、ET－1水平較I／R組低，提示OT對心肌I／R損傷有保護作用，其機制可能是在缺血缺氧狀態(tài)下，血管內皮損傷引起內皮功能障礙，影響了NO的分泌合成，ET－1水平升高，OT可以在一定程度上糾正內皮功能紊亂，使NO的分泌釋放量有所升高，ET－1水平有所下降，血管相對收縮減輕，緩解了心臟缺血缺氧狀態(tài)。NO、ET－1水平表達呈負相關，提示NO和ET－1在心肌I／R后損傷的發(fā)生中可能起協(xié)同作用。

綜上所述，心肌I／R后OT可能通過改善受損內皮的功能，調節(jié)血管活性物質的分泌、釋放及不同物質間的比例，使下調的NO／ET－1趨于正常、恒定，以調節(jié)血管緊張度和局部血流量，恢復血管的自穩(wěn)態(tài)，可能為I／R后心肌損傷的治療開辟了新的領域，值得進一步研究。

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