短期凍存兔骨髓間充質干細胞對其生物特性的影響＊

武成聰，李 強，陳佳濱，茹 嘉，蔡偉良，寧寅寬

（桂林醫學院附屬醫院骨科二病區，廣西桂林541000）

骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是組織工程中重要的種子細胞之一，大量具有良好分化能力的干細胞經多次傳代后老化、分化能力下降或者死亡［1］。將良好分化能力BMSCs凍存則可在需要時及時復蘇應用。而凍存復蘇過程是否會對BMSCs生物特性、骨化潛能造成影響。本實驗旨在探討短期凍存兔BMSCs對其生物特征及其成骨分化能力的影響，為后期組織工程骨構建奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級新西蘭白兔3只，1月齡，體質量約0.5 kg，購于桂林醫學院動物實驗中心，實驗過程符合動物倫理學要求［2］。

1.2 主要試劑 低糖DMEM、胰蛋白酶、胎牛血清購于美國Hyclone公司；MTT、維生素C、β－磷酸甘油、地塞米松購于韓國BIOSHARP公司；小鼠抗兔CD44／CD45單克隆抗體、小鼠抗兔IgG1、PerCP生物素標記山羊抗小鼠IgG（H＋L）分別購于美國 ANTIGENIX、eBioscience、Jackson ImmunoResearch公司；小鼠抗兔CollagenⅠ購于武漢博士德生物工程有限公司；山羊抗小鼠IgG／辣根酶標記、DAB顯色試劑盒購于北京中杉金橋公司；茜素紅購于國藥集團化學試劑有限公司；堿性磷酸酶（ALP）測試盒購于南京建成生物工程研究所。

1.3 方法

1.3.1 細胞分離、凍存 無菌條件下穿刺股骨大轉子抽取骨髓、分離，界面層細胞以含15%胎牛血清的完全培養基，37℃、5%CO2、飽和濕度培養。48h后首次換液，細胞鋪滿瓶底80%左右傳代。第5代加入凍存保護液，程序降溫后液氮保存。30d后復蘇培養，凍存后第10代BMSCs作為實驗組；凍存期間再次分離原代細胞第10代BMSCs作為對照組。

1.3.2 MTT比色法測定吸光度（OD） 實驗組、對照組各以2.5×103個／孔BMSCs接種96孔板，每組8個復制孔，按MTT檢測流程操作，波長490nm下測定OD值，連續檢測7 d，每天OD均值代表細胞增殖情況。

1.3.3 細胞周期檢測 隨機收集實驗組、對照組各3皿細胞固定，流式細胞儀進行細胞周期檢測。重復3次，得出細胞各周期的百分率并計算增殖指數（PI）＝（S＋G2M）／（G0／1＋S＋G2M）。

1.3.4 BMSCs表型檢測 選取實驗組、對照組每組各3皿細胞，設空白管、同型對照管、實驗管，按操作說明分別標記CD44／45－PerCP，流式細胞儀檢測。重復3次，各組陽性率做統計分析。

1.3.5 成骨分化檢測 實驗組和對照組各以105個／孔接種6孔板（免疫組織化學、茜素紅組作爬片處理）。細胞鋪滿瓶底80%后更換成骨誘導液（含10nmol／L地塞米松，15mmol／L維生素C，10mmol／Lβ－磷酸甘油）作不傳代培養誘導7、14d，各組取3孔，按ALP試劑盒說明操作，計算ALP水平。第14天，每組3張細胞爬片，Ⅰ型膠原免疫組織化學染色（SP法）。Image－Pro Plus（IPP）圖像軟件取3個區域測量（100倍，九點法），平均光密度代表單位面積Ⅰ型膠原水平。第21天茜素紅染色，IPP以紅色結節為標志分析鈣結節面積（總像素數）。均重復3次。

1.4 統計學處理 采用SPSS11.0統計軟件進行分析，對各組數據作兩獨立樣本t檢驗，計量資料以表示，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 BMSCs培養情況 原代分離48h后首次換液，鏡下貼壁細胞即為BMSCs，數量較少，呈短梭狀，散在集簇狀分布，隨培養時間延長及傳代后細胞形成大量的小集落，呈長梭狀，匯合成片，旋渦狀排列（圖1A）；實驗組細胞復蘇后24h內細胞可貼壁，不貼壁細胞數目較對照組增加，細胞梭形，較瘦長，部分細胞出現老化，總體而言細胞生長情況影響不大（圖1B）。

圖1 凍存前后兔BMSCs生長情況（×40）

2.2 MTT檢測OD值 實驗組細胞生長潛伏期延長，MTT檢測OD值從第3天開始增加（即細胞增殖速度），第4天后增殖速度能夠與對照組持平，差異無統計學意義（P＞0.05，n＝8），隨后進入平臺期，見表1。

2.3 BMSCs表面標志 實驗組、對照組表面抗原陽性率分別為 CD44：93.62% ±1.05%、93.95% ±0.71%；CD45：0.24%±0.11%、0.29%±0.10%，二者差異無統計學意義（P＞0.05），凍存復蘇對BMSCs表面抗原無明顯影響，細胞并未因凍存而發生變異，見圖2。

表1 MTT檢測OD值±s）

表1 MTT檢測OD值±s）

組別0±0.13 0.47±0.06 0.53±0.07對照組 0.03±0.00 0.06±0.00 0.18±0.04 0.38±0.03 0.48±0.07 0.53±0.08 0.54±0.07 P 1d 2d 3d 4d 5d 6d 7d實驗組 0.03±0.00 0.03±0.00 0.08±0.01 0.29±0.05 0.4 0.21 0.00 0.00 0.00 0.14 0.17 0.81

圖2 第10代BMSCs表面標志表達情況

2.4 BMSCs周期檢測 實驗組與對照組G1、S、G2／M期的細胞比例及PI比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 第10代BMSCs各期細胞比例±s，%）

表2 第10代BMSCs各期細胞比例±s，%）

組別 G1 S G2 57.00±3.47 33.70±3.17 9.29±0.52 42.9±3.4對照組 56.84±2.27 34.20±0.94 8.93±2.41 43.0±2.3 P PI實驗組0.933 0.756 0.768 0.960

2.5 ALP表達情況 實驗組和對照組經成骨誘導后7、14d，隨誘導時間增加ALP水平呈遞增趨勢，兩個時間點實驗組和對照組ALP水平變化差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。>

2.6 Ⅰ型膠原SP法檢測 成骨誘導14d，實驗組和對照組Ⅰ型膠原染色均呈陽性表達，細胞胞質出現棕黃色顆粒，大小形態均一（圖3）。經凍存后BMSCsⅠ型膠原蛋白表達量（平均光密度分析）變化與未凍存組相比，差異無統計學意義（P＞0.05），見表4。

表3 成骨誘導后第7、14天ALP水平±s，U／gprot）

表3 成骨誘導后第7、14天ALP水平±s，U／gprot）

組別6.73±1.92 15.99±4.36對照組 6.76±0.91 16.41±2.22 P 7d 14d實驗組0.97 0.79

2.7 鈣結節茜素紅染色 實驗組和對照組成骨誘導分化培養到約10d細胞呈梭形表面粗糙，細胞間隙緊密，細碎顆粒、扁平樣改變，14d左右漩渦中心形成細胞團，21d形成鈣化結節，肉眼可見培養皿底散在白色狀物，染色后均為紅色（圖4），兩組鈣結節面積差異無統計學意義（P＞0.05），見表4。

圖3 成骨誘導后14dⅠ型膠原染色（SP×100）

表4 Ⅰ型膠原、鈣結節染色情況±s）

表4 Ⅰ型膠原、鈣結節染色情況±s）

組別 平均光密度 鈣結節面積（像素）0.442±0.022 1 055 811.0±199 798.5對照組 0.456±0.015 1 155 874.0±222 157.3 P實驗組0.16 0.32

圖4 導后21d鈣結節茜素紅染色（×100）

3 討 論

BMSCs在特定的條件下能向骨、軟骨、脂肪、肌等細胞分化［3］。本研究采用密度梯度離心法［4］成功分離兔BMSCs，其生長狀態良好，能夠滿足后期骨組織工程種子細胞的要求。而BMSCs體外實驗中，其隨傳代增加會使細胞老化、分化能力逐漸下降或者死亡［5］。低溫凍存BMSCs則是存貯種子細胞的有效途徑，理論上在－196℃及凍存保護液作用下細胞生化反應與活力代謝基本靜止，可無限期凍存細胞［6］。但實際效果不佳，凍存時細胞所處環境對細胞影響較大，其機制可能為溶質反應導致［7］。本實驗中，短期凍存BMSCs后，雖然生長增殖速度較對照組緩慢，但細胞狀態并未發現明顯變化，其增殖能力能與對照組相當。細胞周期中實驗組和對照組的絕大部分BMSCs處于G1期，具有較強的增殖分化能力，凍存后仍具有典型的干細胞增殖特點。

骨髓由多組細胞系組成，對于實驗分離得到及后續凍存復蘇后的BMSCs，是否是種子細胞或者其生物特征是否因細胞凍存過程而改變［8］。本研究通過標記細胞陽性表達的CD44和陰性表達的CD45檢測發現，通過密度梯度離心法獲得的靶細胞為BMSCs，實驗組對照組CD44陽性率均超過90%，不表達的CD45，經統計分析說明了經過短期凍存后的BMSCs并沒有發生分化或變異。

BMSCs成骨、成軟骨、成脂分化這一生物特性可以用來鑒定其多向分化潛能［9－10］。BMSCs的成骨分化必須在特定條件下進行，特定的化學物質（β－磷酸甘油、地塞米松、維生素C等）可促使BMSCs向成骨細胞分化并能通過骨化標志性產物ALP、Ⅰ型膠原、礦化結節等驗證［11］。ALP高表達是成骨過程中成熟成骨細胞特異性標志之一［12］；Ⅰ型膠原蛋白分泌量增加標志著BMSCs向成骨細胞系分化［13］；細胞外基質鈣化與Ca2＋沉積是成骨分化的終末期表現［14］。本研究發現，實驗組和對照組的BMSCs，其ALP表達量均隨誘導時間的增加而相應增加；在相同時間點，實驗組、對照組Ⅰ型膠原蛋白均呈陽性表達，對比光密度發現其表達量并未因凍存細胞而改變。同樣，鈣結節染色也印證了低溫冷凍過程并未使BMSCs成骨分化能力發生質的改變。

綜上所述，本實驗旨在為臨床或實驗研究縮短反復培養鑒定BMSCs的實驗周期，采用密度梯度離心法成功獲得純度較高的兔BMSCs，在其處于最佳狀態時給予凍存復蘇檢測其生物特征及成骨能力是否受到影響。本研究結果顯示，兔BMSCs在短期凍存后其增殖、生物特征及成骨分化潛能無明顯變化，復蘇后可用于進一步研究和應用。

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