不同劑量四氯化碳誘導家兔肝纖維化模型的建立＊

丁 可，劉滿榮，吳奇新，唐建華，曾陽東，馬 宇

（1.廣西壯族自治區南寧市第二人民醫院放射科 530031；2.桂林醫學院附屬醫院放射科，廣西桂林541001；3.廣西壯族自治區南寧市第二人民醫院超聲科 530031；4.桂林醫學院附屬醫院超聲科，廣西桂林541001）

肝纖維化主要表現為肝臟內纖維結締組織的異常增生和沉積，是慢性肝病的重要病理特征，也是各種慢性肝病向肝硬化發展的必經階段。肝纖維化向肝硬化發展是一個潛隱漸進而可逆的過程［1－2］，晚期肝硬化則難以逆轉，因此，及時阻斷肝纖維化發展成為慢性肝病防治中的關鍵問題［3］。肝纖維化動物模型的建立是開展肝纖維化防治研究的重要手段，也是進行人體研究的前提［4］。因飼養簡單及肝臟大小適中，家兔為常用的肝纖維化動物模型；以CCl4誘導肝纖維化模型為國內應用最多的造模方法［5］，但不同劑量CCl4的造模效果有所不同。本實驗擬探討CCl4誘導建立家兔纖維化模型的最佳劑量，以期為相關研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 選用6個月齡雄性健康新西蘭大白兔50只，體質量2.0～2.5kg，由桂林醫學院實驗動物中心提供。隨機分為5組，每組10只。所有家兔均飼養在層疊式不銹鋼絲籠中，飼喂由桂林醫學院實驗動物中心提供的基礎顆粒狀飼料，自由飲用自來水。兔房通風良好，保持清潔，溫度20～29℃，空氣濕度50%～70%。

1.2 方法

1.2.1 實驗試劑及肝穿刺活檢槍 實驗試劑：分析純CCl4（含量≥99.5%），廣東西隴化工股份有限公司生產。肝穿刺活檢槍：半自動型活檢針，規格型號“18GL－130mm”，制造廠商為日本TSK株式會社。

1.2.2 模型制作 分籠正常喂養適應環境1周后開始進行造模。將實驗家兔分為5組：0.2、0.5、1.0、2.0、5.0mL／kg劑量組，根據體質量分別給予相應劑量的分析純CCl4進行每周2次的皮下注射。分別于給藥后的第4、8周，在B超引導下行肝右前葉穿刺活檢術，注意避開肝臟大的血管和膽管，標本長約1.5～2.0cm。造模中途死亡的家兔立即取其肝組織進行病理學檢查。造模后的第12周，采用耳緣靜脈注射空氣栓塞法處死存活的所有實驗兔，取大小約1.5cm×1.0cm×0.3cm的肝臟標本送病檢。

表1 各組家兔用藥后1～12周死亡情況

1.2.3 病理學檢查 對所有肝臟標本分別進行蘇木精－伊紅（HE）及Masson三色染色病理學檢查。以2000年西安會議方案為標準［6］，根據纖維組織增生情況，將肝纖維化分為S0～S45期，動態觀察CCl4誘導建立家兔肝纖維化模型過程中的肝組織病理學變化。

1.3 統計學處理 采用SPSS 17.0統計軟件進行分析。各組家兔死亡率及肝纖維化成模率的比較采用χ2檢驗，組間行χ2分割計算，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組家兔用藥后的死亡情況 各組家兔用藥后1～12周死亡情況見表1。CCl4的給予劑量大于1.0mL／kg時，家兔死亡率顯著增高（≥70%），與前兩組比較差異有統計學意義（P＜0.01）；26只家兔死亡發生在3周之內，5周之后趨于穩定。實驗發現25只家兔死亡發生在給藥后24～48h，其余6只則發生于肝穿刺后的數天。死亡兔的肝臟病理顯示：0.5 mL／kg劑量組第5周死亡兔的肝臟伴有脂肪變，1.0mL／kg劑量組8周死亡兔的肝臟可見纖維化形成，2.0mL／kg劑量組9周死亡兔的肝臟顯示肝纖維化，5.0mL／kg劑量組7周死亡兔的肝臟可見大片壞死伴有纖維化，其余死亡家兔僅可見不同程度的肝細胞腫脹、壞死，均無肝纖維化形成。

2.2 各組家兔用藥后肝纖維化只數及建模成功率 0.2mL／kg組第12周存活兔最多，但只有6只可見肝纖維化形成，建模成功率為60%，其中僅有2只發展為肝硬化（G4S4），另外4只中，2只為 G1S1，G1～2S2和 G3S3各1只。0.5mL／kg劑量組第12周存活兔為7只，但7只均成功建立起肝纖維化模型，故建模成功率最高，達70%，且其中的5只已經發展至肝硬化（G4S4），2只家兔中 G2～3S2和 G3S3各1只）。其余3組建模成功率都較低，且劑量越大成功率越低。后3組肝纖維化成模率顯著低于前2組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 各組家兔用藥后肝纖維化只數及建模成功率

3 討 論

氯化烷烴類化合物CCl4是一種選擇性肝毒性藥物，給予長期反復的CCl4刺激可誘導肝纖維化形成［7］。用CCl4誘導的肝纖維化模型具有成模時間短、簡便、價廉、重復性好及病理特征穩定可靠等特點，在形態學和病理生理學的某些方面與人肝纖維化相似，如兩者均有肝細胞壞死后的再生，實驗動物表現的體征及肝功能異常與人慢性肝病進展為肝硬化時相似，因而成為國內應用最多的造模方法［5］。本研究顯示，家兔肝纖維化的嚴重程度與炎癥關系密切，肝纖維化的程度（病理分期）越重，其炎癥活動度（病理分級）也就越大，說明家兔肝纖維化模型的病理學分級與病理分期呈正相關關系，這與人的慢性肝病－－肝纖維化的病理學特點相似，可見CCl4誘導建立家兔肝纖維化模型的良好效果。用CCl4誘導的肝纖維化動物模型可廣泛應用于肝纖維化發生機制、血清學標志物與組織病理的相關性及抗纖維化藥物的篩選等研究。

CCl4誘導建立肝纖維化模型的途徑有口服、腹腔注射和皮下注射等，多位學者采用皮下注射的方法成功建立起大鼠的肝纖維化／肝硬化模型［8－9］。周賢等［9］將 Wistar大鼠隨機分成血清組、CCl4皮下注射組、CCl4腹腔注射組進行肝纖維化造模，研究顯示CCl4皮下注射組制備肝纖維化模型的動物死亡率較低，肝纖維化形成時間較短，是一種制作肝纖維化模型較好的方法。劉滿榮等［10］通過不同給藥途徑建立家兔肝纖維化模型的對比研究亦認為，皮下注射法CCl4造模是制作肝纖維化模型的最佳給藥途徑。CCl4進入體內15min即可引起肝細胞損害，至48h達到高峰，隨后進入修復階段。1～2d給藥一次容易導致動物急性中毒死亡，而給藥間隔超過4～5d時，肝臟可通過較強的肝細胞再生等修復機制迅速恢復肝功能，因此，有效維持CCl4肝損傷效果的最適合給藥間隔時間為3 d［11］。結合文獻報道，本研究采用皮下注射的方法進行造模，并確定給藥頻率為每周2次。

CCl4為選擇性肝劇毒藥物，其肝毒性作用迅速而劇烈，進入體內48h肝細胞損害達到高峰，易導致動物急性中毒而死亡，故實驗中家兔死亡多發生于給藥后的1～2d。經過一段時間的適應期，動物對CCl4的耐受性相對增強，所以家兔死亡多發生在造模后3周之內，5周之后趨于穩定。另有6只家兔于肝穿刺后的數天死亡，穿刺前的實驗室檢查均顯示肝功能下降明顯，病理標本可見不同程度肝細胞腫脹、壞死伴有出血，故考慮與實驗兔受藥后體質下降，肝功能損害導致易出血傾向或穿刺后急性創傷有關。

CCl4成模時間由給藥途徑和劑量決定，一般造模時間為8周至4個月［12］。Chang等［13］的研究表明，CCl4誘導小鼠肝硬化形成的時間主要取決于CCl4的劑量，增加劑量可以縮短造模時間，但同時使死亡率大大增加，因而在常用且安全有效的皮下注射造模法中，探討建立肝纖維化模型的最佳CCl4劑量實屬必要。1.0、2.0、5.0mL／kg劑量組的家兔死亡率都很高，至12周時的死亡率分別高達70%、90%和100%，顯著高于0.2mL／kg劑量組的20%和0.5mL／kg劑量組的30%，可見CCl4的肝臟毒性作用隨著劑量的增加而增大，安全造模的CCl4給予劑量應該小于1.0mL／kg體質量，否則極易導致家兔急性中毒而死亡。由于死亡率較高，故1.0、2.0、5.0mL／kg劑量組的肝纖維化成模率都較低，僅分別為40%、20%和10%，顯著低于0.2mL／kg劑量組的60%和0.5mL／kg劑量組的70%成模率。實驗結果還顯示，0.5mL／kg劑量組的肝纖維化和肝硬化成模時間都要短于0.2mL／kg劑量組，由此可見，在安全有效造模的前提下，0.5mL／kg劑量的CCl4更易誘導建立肝纖維化／肝硬化模型，可視為建立家兔纖維化模型的最佳CCl4劑量。

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