3種不同模式匯集白膜層法制備濃縮血小板質(zhì)量和保存效果比較

王舒瑩，李曉明，劉震岳，張建民

（承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院：1.輸血科；2.檢驗科，河北承德067000）

目前，國內(nèi)傳統(tǒng)手工制備濃縮血小板（PC）方法包括富含血小板血漿法和白膜法（BC），而匯集白膜層法（PBC）手工制備PC已在歐美國家廣泛開展，且這一方法也逐漸在國內(nèi)推廣［1］。PBC制備PC又分為即時PBC法、BC室溫過夜法和全血（WB）室溫過夜法3種不同模式，后兩種模式是在即時PBC法基礎之上進行改進獲得的工藝，但這兩種模式獲得PC的質(zhì)量及保存效果與即時PBC法有無差異卻不得而知。因此，本研究中采用這3種模式PBC法制備PC并對不同模式獲得的PC質(zhì)量及保存效果進行了比較，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取ABO血型均為O型志愿獻血者63名，所有志愿者均符合《中華人民共和國獻血法》健康檢查標準，其中男38例，女25例，平均（31.15±10.75）歲，志愿獻血者血液來源及PC制備過程均在承德市中心血站完成。依據(jù)制備PBC的3種不同模式將63名志愿獻血者分為：即時PBC組、BC室溫過夜組和WB室溫過夜組，每組21例，采集每名志愿獻血者新鮮WB 400mL。

1.2 儀器及試劑 RC－12BP大型離心機、Coulter 755全自動血細胞分析儀、流式細胞儀、熒光標記抗血小板表面糖蛋白單克隆抗體CD62p－PE（批號：358217）及同型對照IG1－PE（批號：556372）均購于美國貝克曼庫爾特公司；TSCD－201A無菌導管接口機購于日本泰爾茂公司；血小板恒溫保存箱購于蘇州醫(yī)用儀器廠；PAS－ⅢM聯(lián)袋及PAS－ⅢM血小板保存液購于山東威高集團（pH 7.2）；四聯(lián)采血袋購于日本泰爾茂公司；血小板型白細胞過濾器匯集袋購于南京雙威；血小板貯存袋購于美國Haemonetics公司；任一志愿獻血者的新鮮血漿（FFP）；血氣儀及血氣試劑盒購于美國雅培（批號：A11824）；Th肉湯培養(yǎng)基（巰基乙酸酯培養(yǎng)基，批號12A0219）購于武漢眾一生物科學技術(shù)公司；血小板聚集誘導劑二磷酸腺苷（ADP）購于美國sigma公司（批號：A－21169）；UNIC7200型分光光度計購于上海分析儀器廠。

表1 BC室溫過夜組、WB室溫過夜組與即時PBC組相關(guān)指標比較±s，n＝7）

表1 BC室溫過夜組、WB室溫過夜組與即時PBC組相關(guān)指標比較±s，n＝7）

分組血小板計數(shù)第1天 第3天 第5天 第7天紅細胞殘留量第1天 第3天 第5天 第7天陽性表達率第1天 第3天 第5天 第7天CD62p.23±7.34 30.12±8.71 38.45±10.64 42.35±9.27 BC室溫過夜組 14.96±3.18＊ 14.89±3.13＊ 14.85±3.08＊ 14.79±3.01＊ 3.18±0.63 3.07±0.59 2.94±0.63 2.82±0.60 23.89±8.65 28.97±7.89 37.96±9.46 40.78±10.34 WB室溫過夜組 15.93±2.73＃ 15.75±2.59＃ 15.68±2.47＃ 15.54±2.41＃ 3.12±0.58 3.08±0.61 2.87±0.56 2.77±0.59 24.即時PBC組 10.51±3.79 10.31±3.65 10.25±3.62 10.19±3.58 3.21±0.68 3.11±0.64 2.97±0.67 2.87±0.63 25 39±7.69 29.43±9.11 39.12±9.39 41.37±10.49

續(xù)表1 BC室溫過夜組、WB室溫過夜組與即時PBC組相關(guān)指標比較±s，n＝7）

續(xù)表1 BC室溫過夜組、WB室溫過夜組與即時PBC組相關(guān)指標比較±s，n＝7）

＊：P＜0.05，與即時PBC組比較；＃：P＜0.01，與即時PBC組比較。

pH值HSR血小板對ADP聚集率（%）分組能力第1天 第3天 第5天 第7天 第1天 第3天 第5天 第7天 第1天 第3天 第5天 第7天即時PBC組 66.87±8.76 55.43±8.28 50.67±7.99 44.93±8.35 7.12±0.05 7.09±0.04 7.05±0.06 7.08±0.04 84.43±11.29 67.76±10.03 31.17±6.45 21.35±5.49 BC室溫過夜組 67.34±8.42 56.38±8.39 51.17±8.18 46.08±8.09 7.08±0.03 7.11±0.05 7.09±0.04 7.04±0.06 86.49±11.87 77.14±10.76＊50.34±8.34＊39.98±7.34＊WB室溫過夜組 68.49±9.34 65.39±8.15＊59.17±8.64＊53.12±7.69＊ 6.99±0.06 7.03±0.04 7.01±0.06 7.02±0.03 84.29±11.45 68.13±10.28 34.33±6.32 23.17±4.93

1.3 方法

1.3.1 PAS－ⅢM PBC－PC的制備方法 （1）將四聯(lián)袋采集的志愿獻血者新鮮全血（每袋400mL）于（22±2）℃保存，以2 600r／min的轉(zhuǎn)速強離心13min分離出BC，熱合后與聯(lián)袋離斷；（2）將3袋檢驗合格的BC通過無菌導管接口機匯集到PAS－ⅢM 聯(lián)袋中［2］，并往PAS－ⅢM 聯(lián)袋加入100mL PAS－ⅢM血小板保存液（包括沖洗裝BC的袋子所用的PAS－ⅢM）獲得PBC；（3）將PBC輕輕混合均勻后以1 500r／min離心10 min，分離出富含血小板血漿；（4）將富含血小板血漿再以600 r／min輕離心5min以除去殘留的紅細胞，至此即獲得由PBC制備出的PC；（5）將獲得PC通過血小板型白細胞過濾器過濾。即時PBC組上述過程于采集WB當天完成；BC室溫過夜組先在第1天完成前2步分離出BC，將BC于（22±2）℃保存放置過夜，于第2天繼續(xù)后續(xù)步驟；WB室溫過夜組則將 WB于（22±2）℃保存放置過夜，第2天完成全部制備步驟。所有獲得的PC均保存在由2／3PAS－ⅢM和1／3血漿組成的保存液中，于4℃保存7d。

1.3.2 血小板及紅細胞殘留量計數(shù) 于保存期第1、3、5、7天，使用全自動血細胞分析儀對獲得的PC作血細胞計數(shù)。

1.3.3 血小板聚集反應的測定 使用任一志愿獻血者的新鮮貧血小板血漿將3組PC樣本中血小板濃度稀釋到250×109L－1，在250μL稀釋后血小板樣本中加入25μL ADP，再使用血小板聚集儀測定樣本中血小板對誘導劑ADP（濃度為20 μmol／L）的最大聚集率［3］，于保存期第1、3、5、7天各檢測1次。

1.3.4 血小板膜表面糖蛋白CD62p表達率檢測 于保存期第1、3、5、7天，參照文獻［4］應用流式細胞儀對3組PC進行血小板表面糖蛋白CD62p表達率的檢測：在兩只流式細胞儀試管中分別加入IG1－PE及CD62p－PE，隨后加入一組經(jīng)稀釋處理好的血小板樣本，混合均勻后置于避光處20min，再用1%的多聚甲醛于4℃固定，10min后用流式細胞儀檢測CD62表達率。

1.3.5 抗低滲休克（HSR）能力的測定 于保存期第1、3、5、7天，參照文獻［5］使用分光光度計對3組PC的HSR進行測定。分光光度計使用波長630nm，將乏血小板血漿（PPP）調(diào)零，一只測試杯加入用蒸餾水稀釋的樣本（稀釋比例為1.0∶1.5），測最大透光率Tmax，10min后測透光率T10；另一只測試杯則加入用血漿稀釋的樣本（稀釋比例為1.0∶1.5），測透光率 TP。HSR恢復率＝（Tmax－T10）／（Tmax－TP）×100%。

1.3.6 測定pH值 使用血氣分析儀及血氣試劑盒測定3組PC保存期第1、3、5、7天的pH值。

1.3.7 細菌培養(yǎng) 細菌培養(yǎng)采用肉湯培養(yǎng)基，取各組樣本后進行細菌培養(yǎng)。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以s表示；采用獨立樣本t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，結(jié)果以率和構(gòu)成比表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 取各組保存期第1、3、5、7天的樣本進行細菌培養(yǎng)，結(jié)果均無細菌生長。

2.2 BC室溫過夜組與即時PBC組相關(guān)指標比較 與即時PBC組相比，在保存期7d內(nèi)BC室溫過夜組血小板含量均更高，且能改善血小板聚集功能，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而紅細胞殘留量、CD62p陽性表達率、HSR能力、pH值等指標差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

2.3 WB室溫過夜組與即時PBC組相關(guān)指標比較 與即時PBC組相比，在保存期7d內(nèi)全血室溫過夜組血小板含量更高且血小板HSR能力增強，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；而紅細胞殘留量、血小板聚集功能、CD62p陽性表達率、pH值等指標兩組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

3 討 論

PBC制備PC的方法最早由Bertolini等［6］于1989年報道，既往研究報道患者在輸入此方法制備并保存12d的PC仍可使血小板計數(shù)迅速升高且出血時間縮短，而保存期間反映PC功能和質(zhì)量的指標如HSR能力及pH值等均符合要求［7］。此外，PBC手工制備PC具有以下優(yōu)點：（1）PBC法制備的PC保存液由2／3PAS－ⅢM和1／3血漿組成，這使血漿得到了節(jié)約；（2）由于在制備過程中使用多次過濾處理去除了白細胞且保存液中血漿較少，這大大減少了患者再輸注過程中不良反應的發(fā)生；（3）該法制備的 PC保存期可長達7d或以上［8］；（4）患者所需的治療費用明顯降低，正是以上這些優(yōu)點使得PBC制備PC有廣闊的前景。但是傳統(tǒng)的即時PBC制備PC模式要求在1d內(nèi)完成血液的采集、BC分離與合格性的檢測、匯集BC制備PC以及后續(xù)的PC保存處理等多項工作，由于時間緊迫往往增加工作人員的夜間工作量及各采血點到血液中心或中心血站運送血液頻次［9］，給制備工作帶來了很大的不便。為解決上述問題，近年來研究人員嘗試采用BC室溫過夜法和WB室溫過夜法這兩種新模式進行PC制備，但室溫過夜是否會對PC的質(zhì)量及保存效果有所影響卻有待評價。因此，筆者嘗試依據(jù)制備PBC的3種不同模式對志愿者的血液進行分組，以探討這3種PBC模式制備的PC質(zhì)量及保存效果有無差異。

在本研究中，與即時PBC組相比BC室溫過夜PBC組制備的PC含量更高，且能改善血小板聚集功能，而其他相關(guān)指標卻無明顯差異。其原因可能為：剛分離出的BC，其中的白細胞和血小板極易相互黏附聚集形成微聚體，如果此時立即制備PC，由于血小板與白細胞分離不夠完全，一方面可導致血細胞計數(shù)儀無法識別出微聚體中的血小板，從而使即時PBC模式制備出的PC含量往往較低，另一方面也導致血小板聚集功能大大受損。而隨著BC儲存時間的延長（如BC室溫過夜處理），由于血小板對外界刺激的敏感性降低，血小板可與白細胞分離使已形成的微聚體充分解聚，此時的血小板就可以被血細胞計數(shù)儀識別從而使BC室溫過夜模式制備的PC含量增加，而制備出的PC也能重新發(fā)揮其聚集功能［10－11］。此外，最近的研究提示W(wǎng)B室溫過夜PBC法制備的PC含量可較即時PBC制備的 PC平均高出18.60%～33.00%［12－13］，與本研究結(jié)果相符，其原因可能與WB室溫放置過夜后更容易分離出血小板有關(guān)［4］。筆者還觀察到，WB室溫過夜PBC法制備的PC其HSR能力也較即時PBC法制備的PC強，血小板HSR能力與其在體內(nèi)的存活率密切相關(guān)［14］，制備出的血小板HSR能力越強，其形態(tài)與功能也就越接近正常的血小板，但WB室溫過夜PBC法制備的PC其HSR能力增強的原因目前尚不清楚，其機制有待進一步地研究。

本研究中獲得的PC保存于4℃條件下，這與以往PC采取（22±2）℃保存不同，其原因在于本研究采用的是PC保存液由2／3PAS－ⅢM和1／3血漿組成，而傳統(tǒng)方法則完全使用血漿進行PC保存。既往研究表明，在完全使用血漿保存PC時，4℃保存條件下，血小板易發(fā)生激活、凝集等現(xiàn)象，這大大減弱了血小板的功能［15］。而采用PC保存液進行PC保存時，4℃與（22±2）℃條件下保存的PC其功能并無明顯差異［5］，即PC保存液能大大減少4℃條件下血小板發(fā)生激活、凝集的可能，因此在PC保存液中的PC于4℃條件下保存是可行的。此外，本研究涉及長期保存血小板且在研究過程中需多次檢測多項指標，如PC保存于（22±2）℃條件下，將大大增加發(fā)生細菌生長的可能，所以本研究最終采取了4℃條件下保存。

總之，BC室溫過夜PBC法和WB室溫過夜PBC法均能安全、可靠、方便地制備PC，且均可代替即時PBC法制備PC。

［1］陳紅霞，趙風綿，王毅，等.白膜法匯集血小板的現(xiàn)狀和前景［J］.臨床輸血與檢驗，2007，9（2）：189－192.

［2］Pérez－Pujol S，Lozano M，Perea D，et al.Effect of holding buffy coats 4or 18hours before preparing pooled filtered PLT concentrates in plasma［J］.Transfusion，2004，44（2）：202－209.

［3］盧發(fā)強，趙士剛，楊玉清，等.白膜層過夜放置對匯集手工濃縮血小板聚集反應和體外激活的影響［J］.中國輸血雜志，2008，21（5）：364－365.

［4］刁榮華，王澤蓉，黃樸，等.全血室溫過夜制備濃縮血小板制劑的質(zhì)量分析［J］.中國輸血雜志，2011，24（11）：930－932.

［5］趙鳳綿，孫曉紅，張愛紅，等.采用HSR方法測定手工匯集濃縮血小板在不同保存溫度下的保存效果［J］.中國輸血雜志，2008，21（2）：116－118.

［6］Bertolini F，Rebulla P，Riccardi D，et al.Evaluation of platelet concentrates prepared from buffy coats and stored in a glucose free crystalloid medium［J］.Transfusion，1989，29（7）：605－609.

［7］Bertolini F，Rebulla P，Marangoni F，et al.Platelet concentrates stored in synthetic medium after filtration［J］.Vox Sang，1992，62（2）：82－86.

［8］Sandgren P，Shanwell A，Gulliksson H.Storage of buffy coat－derived platelets in additive solutions：in vitro effects of storage at 4℃ ［J］.Transfusion，2006，46（2）：282－834.

［9］Thibauh L，Beaujour A，de Grandmont MJ，et al.Characterization of blood components prepared from whole blood donations after a 24hour hold with the platelet－rich plasma method［J］.Transfusion，2006，46（8）：1292－1299.

［10］Van der Meet PF，de Wildt－Eggen J.The effect of wholeblood storage time on the number of white cells and platelets in whole blood and in white cell－reduced red cells［J］.Transfusion，2006，46（4）：589－594.

［11］Pielerse RN，de Korte D，Reesink HW，et al.Storage of whole blood for up to 24hours at ambient temperature prior to eomponent preparation ［J］.Vox Sang，1989，56（3）：145－150.

［12］Pieter F，vander Meer，Jose A，et al.Evaluation of the overnight hold of whole blood at room temperature，before component processing：platelets（PLTs）from PLT－rich plasma［J］.Transfusion，2011，51（1S）：S45－49.

［13］Lu FQ，Kang W，Peng Y，et al.Characterization of blood components separated from donated whole blood after an overnight holding at room temperature with the buffy coat method［J］.Transfusion，2011，51（10）：2199－2207.

［14］Murphy S，Rebulla P，BeItolini F，et al.In vitm mment of the quality of stored plaielet concentrates.The BEST（biomedieal excellence for safer transfusion）task force of the intemadonal society of blood transfusion［J］.Transfus Med Bey，1994，8（1）：29－36.

［15］Connor J，Currie LM，Allan H，et al.Recovery of in vitro functional activity of platelet concentrates stored at 4℃and treatedwith second－messenger effectors［J］.Transfusion，1996，36（8）：691－698.