小柴胡湯對C6膠質瘤大鼠ESM－1、VEGF表達的實驗研究

于慧玲，麻春杰，蓋 聰

（1.北京中醫藥大學，北京100029；2.內蒙古醫科大學病理教研室，內蒙古 呼和浩特010059）

近年來小柴胡湯的抗腫瘤的藥效作用研究日益受到重視，以往的研究［1，2］證實小柴胡湯對S180、Lewis等荷瘤鼠具有明顯抑瘤作用及提高機體免疫力的作用，對C6膠質瘤抑瘤效果的研究甚少，本實驗通過建立C6膠質瘤大鼠模型，檢測血清及腫瘤組織中ESM－1和VEGF蛋白的水平，探討小柴胡湯的抑瘤機制，為其進一步推廣應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 小柴胡湯組成：柴胡（78.125 g）；黃芩三兩（46.875g）；人參三兩（46.875g）；清半夏半升（42g）；炙甘草三兩（46.875g）；生姜三兩（46.875g）；大棗（30g）。替莫唑胺由江蘇天士力帝益藥業有限公司提供；ELISA試劑盒：ESM－1和VEGF均由南京建成生物有限公司提供；一抗ESM－1和VEGF購于北京博奧森生物有限公司；SP9710試劑盒和DAB顯色試劑盒購于福州邁新生物有限公司。

1.2 實驗分組及模型制備 清潔級Wistar老年雄性大鼠，體重321.5±3.3g，18月齡，60只右前肢腋窩皮下接種2×106/20μl的C6膠質瘤細胞懸液；然后隨機分為6組：腫瘤對照組、陽性藥A組（替莫唑胺；50mg/Kg）、陽性藥 B組（替莫唑胺；25mg/Kg）、小柴胡湯 C組（50g/Kg）、小柴胡湯 D組（20 g/Kg）、小柴胡湯E組（10g/Kg）。

1.3 中藥制備 小柴胡湯組成中的7味中藥，以8倍量蒸餾水浸泡30min，加熱保持微沸30min，過濾；殘渣加6倍量蒸餾水，微沸30min，過濾，合并2次濾液，混合后濾液干燥濃縮至100ml，即小柴胡湯E（10g/ml）；以類似方法濃縮熬制小柴胡湯D（20g/ml）；小柴胡湯 C（50g/ml）；4℃冰箱保存備用。

1.4 給藥方法及取材 每組均分別灌胃給予生理鹽水、陽性藥A、陽性藥B、小柴胡湯C、小柴胡湯D和小柴胡湯E，連續服藥5d，休息4d，共給藥3次，于最后一次給藥后2d處死動物，眼球取血，分離血清（3 000r/min，10min），標記好后置－20℃保存備用；取腫瘤組織（部分－20℃凍存待測，部分固定于10%福爾馬林液中）。

1.5 檢測指標

1.5.1 大鼠血清及腫瘤組織中ESM－1和VEGF蛋白含量的檢測 采用ELISA酶聯免疫法檢測；嚴格按照試劑盒方法操作。

1.5.2 大鼠腫瘤組織中ESM－1和VEGF蛋白水平的檢測 采用免疫組織化學方法檢測；腫瘤組織脫水、包埋、切片4μm，60℃烤箱烘烤6h待測。

1.6 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件進行分析，血清及腫瘤組織中ESM－1和VEGF蛋白含量及腫瘤組織中ESM－1和VEGF的蛋白水平的數據均以±s表示，采用t檢驗，檢驗水準α＝0.05。

2 結果

2.1 各組大鼠血清及腫瘤組織中ESM－1和VEGF蛋白含量的比較 與腫瘤對照組比較，小柴胡湯各劑量組大鼠血清及腫瘤組織中ESM－1、VEGF蛋白含量均降低，且隨劑量增長降低趨勢明顯差異有統計學意義（P＜0.01），陽性藥各劑量組大鼠血清及腫瘤組織中ESM－1、VEGF蛋白含量亦均降低，且隨劑量增長降低趨勢明顯差異亦有統計學意義（P＜0.01），見表1。

表1 小柴胡湯對C6膠質瘤大鼠血清、腫瘤組織中ESM－1、VEGF蛋白含量的影響（±s）

表1 小柴胡湯對C6膠質瘤大鼠血清、腫瘤組織中ESM－1、VEGF蛋白含量的影響（±s）

1）與腫瘤對照組比較，P＜0.01；2）與陽性藥 A組比較，P＜0.01；3）與小柴胡湯C組比較，P＜0.01。

分組 n 血清ESM－1（pg/ml） VEGF（pg/ml）腫瘤組織ESM－1（pg/ml） VEGF（pg/ml）.93陽性藥A組 10 3.01±0.621） 3.24±0.711） 7.41±0.591） 6.72±0.861）陽性藥B組 10 7.61±0.922） 8.01±1.052） 12.11±2.082） 11.62±1.782）小柴胡湯C組 10 2.11±0.182） 2.01±0.422） 4.75±0.492） 4.22±0.372）小柴胡湯D組 10 5.06±0.773） 5.42±0.833） 9.86±1.073） 8.19±1.313）小柴胡湯E組 10 10.73±1.223） 10.15±1.163） 15.37±1.663） 14.99±1.533）腫瘤對照組 10 12.63±1.01 11.28±1.36 18.92±2.14 18.61±1

2.2 各組大鼠腫瘤組織中ESM－1和VEGF蛋白水平陽性強度的比較 與腫瘤對照組比較，小柴胡湯各劑量組大鼠腫瘤組織中ESM－1、VEGF蛋白陽性表達強度均降低差異有統計學意義（P＜0.01），C組、D組降低較為顯著但二者之間差異無統計學意義（P＞0.05）；陽性藥各劑量組大鼠腫瘤組織中ESM－1、VEGF蛋白陽性表達亦均降低，且隨劑量增長降低趨勢明顯差異亦有統計學意義（P＜0.01），陽性藥A組、小柴胡湯C組和D組這三組之間差異無統計學意義（P＞0.05），見圖1、2；ESM－1、VEGF蛋白陽性表達強度采用 Motic Images Advanced 3.2圖像分析系統檢測灰度值，灰度值越大陽性表達越低，灰度值越小陽性表達越高，比較結果見表2。

圖1 各組ESM－1的表達（200×，免疫組織化學方法染色）

圖2 各組VEGF的表達（200×，免疫組織化學方法染色）

表2 小柴胡湯對C6膠質瘤大鼠腫瘤組織中ESM－1、VEGF蛋白水平（灰度值）的影響（xˉ±s）

3 討論

血管內皮生長因子（vascular endothelial grow th factor，VEGF）是重要的血管生成因子之一，能使血管內皮細胞變形、移動、分裂增殖，增加血管通透性促進腫瘤新生血管形成［3］。人內皮細胞特異分子－1（endothelial cell specific molecule－1，ESM－1）是一種可溶性的蛋白聚糖，由一條硫酸皮膚素鏈和一個核心蛋白相連而成，其基因位于人第五號染色體5q11.2上，含3個外顯子和2個內含子［4］。它的表達受細胞因子、血管生長因子、轉錄因子等多種因素的復雜調控［5］。內皮細胞特異分子－1與人類多種腫瘤關系密切，可以促進腫瘤形成、生長和轉移。最初是由 Lassalle等［6］發現的。Bechard等［7］證實了ESM－1是作為一種可溶性的蛋白多糖－硫酸軟骨素分泌至血液中，又稱為Endocan。目前的研究發現，在諸如肺癌、乳腺癌、子宮癌、腎癌、涎腺腺樣囊性癌、肝癌、腦神經膠質細胞瘤等許多人體實體腫瘤中ESM－1都高表達，同時也發現該因子的高表達與腫瘤的預后、轉移、血管增生等因素有關［8］。

本實驗研究以此論點為基礎，檢測C6膠質瘤大鼠模型經小柴胡湯治療后ESM－1和VEGF在血清及腫瘤組織中的表達，檢測結果顯示：與腫瘤對照組比較，小柴胡湯各劑量組大鼠血清及腫瘤組織中ESM－1、VEGF蛋白含量和蛋白表達水平均降低，蛋白含量隨劑量增長降低趨勢明顯差異有統計學意義（P＜0.01），蛋白表達水平C組、D組降低較為顯著但二者之間差異無統計學意義（P＞0.05）；陽性藥各劑量組大鼠血清及腫瘤組織中ESM－1、VEGF蛋白含量和蛋白水平亦均降低，且隨劑量增長降低趨勢明顯差異亦有統計學意義（P＜0.01）；陽性藥A組、小柴胡湯C組和D組這三組之間在腫瘤組織蛋白表達水平上差異無統計學意義（P＞0.05）；這一結果與Lassalle、Bechard學者的論點相一致，提示：小柴胡湯能夠通過下調ESM－1和VEGF蛋白在血清及腫瘤組織中的水平，抑制腫瘤新生血管的形成，從而發揮其腫瘤治療方面的作用，并在劑量上為臨床用藥提供了可靠的依據。

［1］梁靚靚，殷東風，周立江.小柴胡湯對Lewis荷瘤小鼠抑瘤及免疫功能影響的初步研究［J］.中醫藥通報，2008，7（5）：61.

［2］張豐華，黃秀深，牛朝陽，等.小柴胡湯對S180荷瘤小鼠腫瘤血管生成的影響［J］.中醫藥學刊，2004，22（2）：269.

［3］史 璐，汪說之，陳新明，等.涎腺粘液表皮樣癌中血管生成與腫瘤細胞增殖的研究［J］.武漢大學學報（醫學版）2004，25（4）：426.

［4］陳超陽，陳維榮.內皮特異分子1與腫瘤的研究進展［J］.醫學綜述，2011，17（12）：1806.

［5］Rong Cong，Xiaobing Jiang，Christine M Wilson，et al.Hhex is a direct repressor of endothelial cell－specific molecule 1 （ESM－1）［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，346（2）：535.

［6］Lassalle P，Molet S，Janin A，et al.ESM－1is a novel human endothelial cell－specific molecule expressed in lung and regulated bycytokines［J］.J Biol Chem，1996，271（34）：20458.

［7］Bechard D，Gentina T，Delehedde M，et al.Endocan is a novel chondroitin sulfate/dermatan sulfate proteoglycan that promotes hepatocyte growth factor/scatter factor mitogenic activity［J］.J Biol Chem，2001，276（51）：48341.

［8］龍 馳，張 濛，張明慧，等.內皮細胞特異分子－1與人類腫瘤關系的研究進展［J］.現代腫瘤醫學，2013，21（5）：1162.