循環腫瘤細胞與肺癌臨床病理特征的關系＊

劉春花，楊 政，李 娜，鞏 平△

（1.石河子大學醫學院，新疆石河子832000；2.石河子大學第一附屬醫院腫瘤內科，新疆石河子832000）

肺癌是嚴重威脅人類健康的疾病之一，發病率呈逐年上升趨勢，病死率居所有惡性腫瘤之首。其遠處轉移是導致患者死亡的主要原因。循環腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTC）的出現是發生遠處轉移的前提，是形成轉移灶的關鍵環節［1－2］。有研究顯示，CTC不僅可有效判斷肺癌患者預后，還能預測和監測輔助治療效果［1，3］。本研究旨在應用免疫磁珠陰性富集聯合免疫熒光細胞化學法檢測肺癌患者的CTC，分析其與患者臨床病理因素的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集石河子大學醫學院第一附屬醫院2012年9月至2013年6月肺癌患者65例（肺癌組），男49例，女16例，年齡40～76歲，平均60.8歲；鱗癌24例，腺癌19例，小細胞肺癌13例，其他（腺鱗癌、大細胞癌、肺泡細胞癌、癌肉瘤）9例。肺良性疾病患者10例（肺良性疾病組），男7例，女3例，年齡38～73歲，平均58.3歲；肺炎4例，支氣管哮喘急性發作3例，慢性阻塞性肺疾病（COPD）急性發作2例，慢性支氣管炎急性發作1例。健康志愿者10例（健康組），男6人，女4人，年齡35～70歲，平均56.1歲。納入研究對象按各自設定標準。肺癌組納入標準：（1）年齡18～80歲；（2）經組織病理學檢查確診為肺癌；（3）入組前未接受任何抗腫瘤治療。排除標準：（1）缺乏肺癌病理學診斷；（2）已接受手術化療及放療；（3）有其他惡性腫瘤病史；（4）依從性差。肺良性疾病組納入標準：（1）符合非腫瘤相關疾病臨床診斷標準；（2）有微生物學或組織學證據；（3）病理學檢查除外肺惡性腫瘤。健康組納入標準：（1）年齡18～80歲；（2）無肺癌相關高危因素；（3）常規體檢及肝腎功能無異。肺良性疾病組及健康組統稱對照組，所有研究對象均簽署知情同意。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑 抗CD45磁珠抗體購自德國Miltenyi Biotec公司；鼠抗Pan－CK購自美國Cell Signaling公司；Envision試劑盒購自中杉金橋公司（批號：Cat NO.D11－110）。

1.2.2 樣本采集 嚴格消毒后，應用真空采血針采集肘正中靜脈血，棄去穿刺后的前2mL，采集此后的7.5mL靜脈血加入乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管，并在采集后的24h內富集腫瘤細胞。

1.2.3 免疫磁珠富集 將血液和淋巴細胞分離液復溫至18～25℃，取7.5mL抗凝血與等量PBS液充分混勻后，緩慢貼壁加入淋巴細胞分離液層面上（2∶1）；室溫下2 000r／min（離心半徑16cm）離心20min；吸取環狀乳白色單核細胞層，加入5 mL PBS液重復洗2次，室溫下2 000r／min（離心半徑16cm）離心15min。將細胞沉淀重懸于80μL磁珠緩沖液中，加入20μL抗CD45抗體，用手輕輕敲打混勻后置于4℃冰箱孵育15min；再加入2mL磁珠緩沖液，室溫下2 000r／min（離心半徑16cm）離心10min；棄上清液（用槍尖吸取上清液，留1mm水膜），加入500μL緩沖液重懸細胞。將細胞重懸液過磁珠MS分流柱，加入500μL磁珠緩沖液洗滌MS分流柱2次，收集從分流柱下流出的液體，室溫下2 000r／min（離心半徑16 cm）離心10min；棄上清液，沉淀均勻涂于防脫載玻片上，室溫風干后4%多聚甲醛固定10min，PBS洗3次，每次5min，室溫風干。如不立即進行免疫細胞化學染色，待玻片干燥后置于－80℃冰箱備測。

｀1.2.4 免疫細胞化學染色（Envision法） 取出切片，PBS洗3次，每次5min，加入細胞角蛋白（Pan－CK）抗體，4℃冰箱過夜。PBS洗3次，每次5min，加二抗（Envision工作液），37℃溫箱孵育20min。PBS浸洗3次，每次5min，DAB溶液顯色。蘇木素復染3～5min，酸酒精分化、脫水、透明、中性樹膠封片。

1.2.5 CTC的判定標準及陽性定義 形態學標準：（1）細胞呈圓形、橢圓形或長形，長徑大于10μm；（2）光鏡下可見完整細胞形態及細胞核。光鏡陽性標準：（1）有完整細胞膜，Pan－CK染色陽性，細胞質呈藍黑色或褐色；（2）細胞長徑大于10 μm；（3）核漿比失常。結果判定：由兩位經培訓實驗員在光鏡下分別觀察細胞顯色情況，有分歧時由第3人協助判定。陽性界定值：目前尚無國際標準化CTC的陽性判定標準，本文以見到CTC即為陽性結果。

1.3 統計學處理 實驗數據采用SPSS17.0軟件進行統計分析，計數資料采用列聯表分析，確切概率法檢驗，計量資料以±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 CTC檢測結果 對照組（20例）中均未檢出CTC，肺癌組中45例檢出CTC，陽性率為69.23%（45／65），CTC數值為1～58個，中位數4個。兩組比較差異有統計學意義（χ2＝8.047，P＝0.018），見圖1。

圖1 免疫細胞化學染色結果（Envision×400）

2.2 CTC與肺癌患者臨床病理特征的關系 對65例肺癌患者CTC與臨床特征間的關系進行統計分析，結果表明，TNM分期Ⅰ～Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期患者CTC陽性率分別為23.08%（3／13）、50.00%（6／12）、90.00%（36／40），各亞組 CTC陽性率差異有統計學意義（P＝0.000）；轉移性（M1期）肺癌患者CTC陽性率為83.33%（35／42），較非轉移性（M0期）肺癌患者CTC陽性率43.48%（10／23）顯著升高（P＝0.002）；隨著轉移部位個數（0、1、2、3）的增多，CTC陽性率呈升高趨勢（43.48%、83.33%、87.50%、75.00%），各亞組CTC陽性率差異有統計學意義（P＝0.024）；CTC陽性率在Pan－CK19片段（Cyfra21－1）＜5.6μmol／L組（53.33%，16／30）與Cyfra21－1≥5.6μmol／L組（82.86%，29／35）間差異有統計學意義（P＝0.021）；在乳酸脫氫酶（LDH）＜270U／L組（55.0%，22／40）與LDH≥270 U／L組（92.0%，23／25）間差異也有統計學意義（P＝0.004）。而CTC陽性率與肺癌患者病理類型、腫瘤大小、淋巴結轉移、遠處轉移的部位及癌胚抗原（CEA）值均無關（P＞0.05），見表1。

表1 65例肺癌患者CTC與臨床病理特征的關系

續表1 65例肺癌患者CTC與臨床病理特征的關系

3 討 論

遠處轉移是肺癌的惡性標志和重要特征，也是導致肺癌患者治療失敗和死亡的主要原因。而研究顯示，CTC與肺癌患者的隱性微轉移密切相關，是發生遠處轉移的前提，形成轉移灶的關鍵環節［1－2］。本研究發現，在13例早期肺癌患者中有3例（23.08%，3／13）檢出CTC，同樣證明CTC的全身擴散是肺癌發生、發展的早期事件，雖然血液中檢測到CTC并不意味著必定形成轉移灶，但有助于及早確定轉移復發高危人群，加強這部分患者的隨訪并采取相應的治療措施，對減少腫瘤的轉移復發、提高生存率具有重要意義。

隨著現代生物學技術的飛速發展，在CTC檢測中，細胞富集技術、免疫學技術得到了廣泛應用，使得檢測的敏感性和特異性亦大大提高［4］。目前，免疫細胞化學染色仍是評價CTC檢測方法的金標準［5］。由于該技術檢測的細胞數量少，檢出率低，本研究加用了免疫磁珠陰性富集法富集CTC，以更好地獲取腫瘤靶細胞。免疫磁珠系統對外周血CTC具有高效的回收率（＞85%）［6］。本實驗中，采用免疫磁珠陰性富集聯合免疫細胞化學染色分離鑒定CTC，65例肺癌患者中45例檢出CTC，總陽性率為69.23%，與周小昀等［7］報道基本一致；10例肺良性疾病患者及10例健康志愿者中均未檢出CTC，證實檢測具有極高的特異性（100%）。

近幾年，大量的研究證明CTC在肺癌復發轉移中起重要作用，是可能更有效評估患者預后，及時監測病情進展的指標。De Giorgi等［8］研究發現，CTC對腫瘤患者的預后預測較其他的方法更準確，比PET－CT的方法更加敏感和經濟。Hou等［9］檢測了97例小細胞肺癌患者的CTC，發現CTC計數與無進展生存期（PFS）、總生存期（OS）均呈負相關，多因素分析顯示，CTC可作為患者PFS和OS的獨立預測指標。Krebs等［10］檢測了101例晚期非小細胞肺癌患者CTC，亦得出CTC計數是預測患者OS的最有價值的獨立指標。因此，檢測肺癌CTC狀態對準確判斷患者預后，及早發現疾病進展及制訂個體化治療方案具有重要意義。本研究分析65例肺癌患者CTC與臨床特征的關系，結果顯示CTC陽性率與患者病理類型、腫瘤大小、淋巴結轉移、遠處轉移的部位（肝、腦、骨、腎上腺、胸膜）無關，與肺癌患者的臨床分期、M分期、發生遠處轉移部位的個數密切相關，與國外研究結果相一致［11］。臨床分期越晚，CTC檢出率更高，且M1期患者CTC陽性率較M0期患者明顯升高（83.33%vs.43.48%），提示CTC陽性與遠處轉移密切相關，進一步證實了CTC在遠處轉移病灶形成中的重要作用；而在M0期即影像學未發現遠處轉移的患者中仍有如此高的CTC檢出率，提示在監測肺癌遠端轉移方面，CTC較傳統的影像學等檢查更加及時、敏感，有利于肺癌患者的個體化治療。

腫瘤標志物反應腫瘤的發生、存在與生長。國外有研究報道［12］：腫瘤標志物升高程度與癌細胞數量及轉移有關。血清中Cyfra21－1的水平可作為肺癌手術和放化療后追蹤早期復發或轉移的有效指標，其高值提示疾病處于進展期且預后不佳［13－14］。LDH是一種糖酵解酶，在惡性腫瘤患者中LDH 明顯增高［15］，且有報道血清LDH隨著肺癌患者病情的進展呈逐漸升高的趨勢［16］。本文觀察了Cyfra21－1及LDH與CTC的關系：Cyfra21－1、LDH二者高值組CTC陽性率較低值組明顯升高 （Cyfra21－1：53.33%vs.82.86%；LDH：55.00%vs.92.00%），初步研究表明CTC與Cyfra21－1及LDH具有一定相關性，下一步應擴大樣本量，并對患者進行隨訪跟蹤，動態監測患者CTC、Cyfra21－1及LDH，觀察其治療后是否仍具有相關性，進一步研究CTC在判斷肺癌患者預后的臨床價值。

CTC是形成遠處轉移灶的重要前提和基礎，及早檢測CTC對臨床醫師準確判斷預后和病情具有重要指導作用；動態監測患者CTC變化，有利于及時了解患者病情，為制訂個體化的治療方案提供依據。本研究僅初步探討了肺癌患者CTC與臨床病理特征之間的關系，未來的研究應通過隨訪觀察，進一步闡述CTC與肺癌患者預后的關系，并對CTC在肺癌綜合治療中的應用價值進行深入探討。

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