肝素酶和CD44v6在非小細胞肺癌中的表達及意義

鄧太兵，黃萬秀，唐鳳鳴

（1.四川省廣安市人民醫院呼吸內科 638500；2.四川省宜賓市第一人民醫院呼吸內科 644000）

肺癌是世界范圍內發病率和病死率最高的惡性腫瘤，其中非小細胞肺癌（nonsmall－cell lung cancer，NSCLC）在肺癌患者中所占比例約為80%；作者既往研究發現在NSCLC組織中CD44的表達率為52.27%［1］。CD44v6是CD44家族的主要成員，在腫瘤的轉移過程中促進腫瘤細胞與細胞間質的黏附；而肝素酶是目前發現的惟一能夠降解細胞外基質和基底膜的內源性糖苷酶，在腫瘤的轉移中具有重要的作用；腫瘤的侵襲和轉移是腫瘤致死的主要原因，基于以上分析，本研究擬檢測肝素酶及CD44v6在NSCLC組織中的表達，討論這兩種分子在NSCLC中表達的意義及其與預后的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集本院2009年1月至2011年12月手術切除經病理證實為NSCLC的腫瘤標本117例（肺癌組），取其中62例患者癌旁1cm并且經病理學檢查證實為正常的肺組織為陰性對照（癌旁組）。其中男88例，女29例；年齡29～89歲，中位年齡57歲；病理分型為鱗癌36例，腺癌57例，腺鱗癌8例，支氣管肺泡癌13例，大細胞癌3例，病理學診斷由兩名以上具有10年以上工作經驗的病理學專家確診。NSCLC患者的TNM分期按2009年第7版肺癌TNM分期標準進行，其中Ⅰ期24例，Ⅱ期64例，Ⅲ期29例；其中有淋巴結轉移者68例，無淋巴結轉移患者49例；隨訪截止日期為2013年6月，生存期的計算為自手術日期至隨訪截止日期或死亡日期為止，結尾值為0，術后患者平均生存時間為27.6個月。

1.2 主要試劑 小鼠抗人CD44v6單克隆抗體購于美國RnD公司（Catalog：BBA13）、兔抗人肝素酶單克隆抗體購于美國Santa公司（Catalog：sc－25826）；辣根酶標記的山羊抗小鼠二抗（Catalog：ZB－2305）、山羊抗兔（Catalog：ZB－2301）二抗及 DAB顯色試劑盒（Catalog：ZLI－9032）購于北京中山金橋生物技術公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學染色 腫瘤組織及癌旁正常組織石蠟切片使用二甲苯脫蠟，采用梯度乙醇水化。將切片放置在終濃度為0.01mol／L、pH值為6.0的檸檬酸鹽酸緩沖液中在溫度為97～100℃條件下進行微波抗原修復15min，切片置室溫冷卻30min，用PBS沖洗3次，每次5min；然后分別滴加一抗后于4℃冰箱中孵育過夜，用PBS清洗3次，每次5min；按照一抗來源分別加入二抗并在37℃孵育30min，然后用PBS清洗3次，每次5min；嚴格按照DAB顯色試劑盒進行顯色，蘇木精復染，PBS代替一抗作為系統陰性對照。

1.3.2 圖像分析 使用日本Olympus公司生產的CX21顯微鏡，放大倍數為400倍觀察免疫組織化學切片，并進行半定量評估，判定標準：細胞膜或細胞質染色即判定為陽性；參照Mathew等制定的分級標準，無陽性細胞或者陽性細胞小于5%為陰性（－），染色為黃色的細胞大于0小于50%或細胞染色為棕黃色的細胞小于30%為陽性（＋），染色為黃色的細胞大于50%或棕黃色細胞大于30%者為強陽性（＋＋）。

1.4 統計學處理 采用SPSS13.0軟件進行統計學分析，CD44v6和肝素酶的表達與臨床病理因素關系采用χ2檢驗，CD44v6和肝素酶的表達相關性分析采用Spearman等級相關因素分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 CD44v6和肝素酶在NSCLC中的表達 CD44v6表達于腫瘤細胞質及胞膜呈黃色或棕色顆粒，CD44v6在癌旁組的陽性表達率為4.8%（3／62），在肺癌組中的陽性表達率為54.7%（64／117），肺癌組 CD44v6的陽性率顯著 高于癌旁組 （χ2＝42.642，P＝0.0001）；肝素酶表達于肺癌細胞質，肝素酶在癌旁組的陽性表達率為17.7%（11／62），在肺癌組中肝素酶的陽性表達率為86.3%（101／117），肺癌組肝素酶的陽性率顯著高于癌旁組（χ2＝81.389，P＝0.000 1），見表1、圖1。

表1 CD44v6、肝素酶在肺癌及癌旁正常肺組織中的表達（n）

圖1 CD44v6、肝素酶在肺癌組織中的表達（免疫組織化學×400）

表2 CD44v6與肝素酶在NSCLC TNM分期及淋巴結轉移的關系（n）

2.2 CD44v6與肝素酶在NSCLC中的表達與肺癌轉移的關系 CD44v6和肝素酶的表達程度與NSCLC的臨床分期和淋巴結轉移相關，CD44v6在淋巴結轉移陽性患者中陽性表達率為61.7%（42／68），在淋巴結轉移陰性患者的陽性表達率為44.9%（22／49），兩組間比較差異有統計學意義（χ2＝27.736，P＜0.05）；肝素酶在淋巴結轉移陽性患者中陽性表達率為94.1%（64／68），在淋巴結轉移陰性患者的陽性表達率為75.5%（37／49），兩組間比較差異有統計學意義（χ2＝8.352，P＝0.000 1），見表2。

2.3 CD44v6與肝素酶表達的相關性 通過Spearman相關性分析結果發現CD44v6與肝素酶在NSCLC中的表達存在顯著正相關（r＝0.894，P＜0.05），見表3。

表3 兩種蛋白在NSCLC中的表達相關關系（n）

3 討 論

作者既往的研究表明在非小細胞肺癌患者中，CD44高表達組的生存率明顯低于CD44低表達組，這個結果與其他學者的研究報道相接近［2－4］。在本研究中作者采用免疫組織化學檢測NSCLC患者肺癌組織及相關的癌旁組織中CD44v6的表達情況，發現CD44v6蛋白在癌旁正常肺組織中的陽性表達率明顯低于NSCLC組織，并且CD44v6在淋巴結轉移陽性的患者中陽性表達率顯著高于淋巴結轉移陰性患者的陽性表達率，提示CD44v6可能與NSCLC的轉移具有一定的關系，既往文獻亦報道了CD44v6還與胃癌、大腸癌、乳腺癌的轉移相關［5－9］，本研究結果與其他學者的研究結果相似。CD44v6是黏附分子CD44家族的主要成員，在腫瘤的侵襲與轉移中，CD44v6主要參與了腫瘤細胞與細胞外基質的黏附，而黏附在腫瘤細胞的侵襲轉移過程中具有重要的作用。

既往已有大量的文獻表明肝素酶在多種不同組織來源的惡性腫瘤細胞中高水平表達，肝素酶是目前發現的惟一一個能夠水解細胞外基質及基底膜的主要成分硫酸乙酰肝素糖蛋白（HSPG）糖鏈的內源性糖苷酶，而HSPG是細胞外基質及基底膜的主要成分，其主要生物功能是維持細胞外基質的穩定，限制細胞的遷移及黏附，并且HSPG是構成血管壁的主要成分，能夠維持血管壁結構完整并支撐增殖遷移的內皮細胞。既往的文獻報道肝素酶的表達水平與肺癌、乳腺癌、胃癌、結腸癌、宮頸癌等腫瘤的預后呈負相關［10］，抑制肝素酶的活性，可顯著改善腫瘤患者的預后［11］。并且，既往的文獻報道，肝素酶在裂解細胞外基質及基底膜時，可導致釋放多種細胞因子，促進腫瘤新生血管的生成，為腫瘤在轉移器官內增殖提供血供［12］，抑制肝素酶活性，有效阻止腫瘤細胞的侵襲與轉移［13］，目前已有學者將肝素酶作為腫瘤免疫治療的靶點［14－17］。本研究結果發現在肺癌組織中肝素酶的陽性表達率顯著高于癌旁正常肺組織，并且肝素酶在淋巴結轉移陽性患者中肝素酶的陽性率明顯高于淋巴結轉移陰性患者，該結果與既往的文獻報道相一致，這個結果也說明肝素酶的表達水平越高，NSCLC的腫瘤細胞就越容易出現轉移。

侵襲和轉移是惡性腫瘤的重要特征，也是腫瘤致死的主要原因，而腫瘤的侵襲、轉移過程是多階段、多步驟、多因素參與的，首先腫瘤通過抑制黏附因子的表達，使得腫瘤細胞容易從原發灶脫離，形成游離細胞并分泌各種多種酶（如金屬蛋白酶、肝素酶）破壞細胞外基質及基底膜進入循環系統；然后腫瘤細胞通過增強黏附分子的表達（如CD44v6），促進腫瘤細胞錨定在靶器官的毛細血管壁上，并穿透血管壁進入靶器官，形成新的轉移灶。腫瘤的轉移過程復雜，包含許多因素，轉移過程中有許多相對獨立的步驟，只要其中任何一個步驟受限，其轉移就不能實現。本研究發現在NSCLC中，CD44v6和肝素酶的表達具有相關性，在腫瘤的轉移過程中這兩種分子過表達可能在促進腫瘤轉移上具有相輔相成的作用，因此在臨床上可以將CD44v6及肝素酶的表達作為NSCLC預后的指標，進一步的研究正在進行中。

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