siRNA沉默EZH2表達對人膀胱癌細胞遷移和凋亡的影響＊

王海峰，楊 宏，胡禮炳，雷永虹，秦 揚，李 俊，畢城偉，霍 倩

（1.昆明醫科大學第二附屬醫院泌尿外科，昆明 650101；2.昆明醫科大學第三附屬醫院泌尿外科，昆明 650101）

膀胱癌是泌尿系統最常見的惡性腫瘤之一，在國內其發病率和病死率均占泌尿系腫瘤的首位，且近年有增加趨勢，男性發病率約為女性的4倍，易發生浸潤和轉移，且術后復發率高［1］。近年來隨著人們對腫瘤發病機制研究和分子生物學技術發展的深入，基因靶向治療在臨床中受到越來越多的關注，因此尋找治療膀胱癌的分子靶點具有十分重要的意義。果蠅的Enhancer of Zeste基因增強子人類同源物2（ebgabcer of zest homolog，EZH2）是多梳基因家族（polycomb group，PcG）的主要成員，是組蛋白H3第27位賴氨酸特異性的甲基化轉移酶，通過沉默與細胞分化、抑制增殖相關基因而導致腫瘤的發生［2］。多項研究顯示其過量表達與非小細胞肺癌［3］、結腸癌［4］、急性淋巴細胞白血?。?］、前列腺癌［6］、卵巢癌［7］等多種腫瘤發生、發展和預后相關。本研究以EZH2基因為靶點，設計構建其小干擾RNA（siRNA）的表達載體并轉染膀胱癌T24細胞，觀察EZH2基因對膀胱癌細胞增殖、侵襲、遷移能力及凋亡的影響，旨在為膀胱癌的基因治療尋找新的靶點提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 膀胱癌T24細胞株由昆明醫科大學重點實驗室保存，RPMI 1640培養基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶乙二胺四乙酸（EDTA）、磷酸鹽緩沖液（PBS）、LipofectamineTM2000轉染試劑、ECL化學發光檢測試劑購自美國Invitrogen公司，二甲亞砜（DMSO）購自美國Amersco公司，EZH2抗體購自美國Abcam公司，EZH2siRNA套裝購于廣州銳博生物公司，聚氟乙烯（PVDF）膜購于美國Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 膀胱癌癌細胞株T24分別在含10%胎牛血清的90%RPMI 1640培養基中，于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養。

1.2.2 重組質粒構建及轉染 根據GeneBank提供的EZH2基因序列，使用在線設計軟件，通過基因序列比對，合成EZH2特異性siRNAs序列5′－GGG AAA GUG UAU GAU AAU TT－3′，陰 性 對 照 siRNAs 序 列 為 5′－UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT－3′。將其合成序列插入到 PGenesil－1.1質粒構建重組體，并轉化至大腸埃希菌DH5α感受態細胞中。分別挑取菌落接種于含4mg／mL新霉素的RPMI 1640培養基培養，再使用堿裂解法抽提質粒，并行酶切鑒定和測序分析。轉染按照LipofectamineTM2000脂質體轉染試劑盒說明書的要求進行，每孔siRNA為4μg，LipofectamineTM2000的用量為10 μL，轉染后置入CO2培養箱，6h后換液，繼續培養48～72h后收集細胞。實驗分為空白對照組（不經任何處理）、陰性對照組和干擾組（分干擾1組、干擾2組、干擾3組）。

1.2.3 轉染后RNA提取及實時熒光定量PCR 以NCBI數據庫中NM＿004456和NM＿152998為參考，設計EZH2的siRNA各3條（廣州銳博生物合成）。收集轉染48h后的T24細胞，按天根DP431試劑使用說明書提取細胞的總RNA，經檢測濃度和完整性后，按反轉錄試劑盒使用說明操作。先逆轉錄生成cDNA，再以各組cDNA為模板對EZH2基因和內參βactin進行實時熒光定量PCR反應。每一個樣品均做3個重復反應。同時設無模板對照。在熒光定量PCR儀上進行檢測。反應條件：95℃15s；95℃5s、60℃60s，30個循環；擴增完畢后進行熔解曲線分析：95℃15s，60℃30s，72℃30s。對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析特異性。實時定量分析采用2－ΔΔCt方法。β－actin上游引物5′－GGT CTC CTC TGA CTT CAA CA－3′，下游引物 5′－GAG GGT CTC TCT CTT CCT－3′；EZH2 上 游 引 物 5′－GCG CGG GAC GAA GAAT AAT CAT－3′；下游引物5′－TAC ACG CTT CCG CCA ACA AAC T－3′。

1.2.4 MTT法檢測細胞增殖情況 將傳4～6代的T24細胞用0.25%胰蛋白酶消化后計數，按2×103／孔的濃度接種96孔板，置37℃，5%CO2培養箱中培養18h。更新鮮培養基后培養2h，轉染EZH2－siRNA進細胞。24h后開始檢測，設置調零孔、對照孔，每組3復孔。置37℃，5%CO2培養箱中培養30min。離心棄去上清，加入含500μg／mL MTT 的DMEM／F12培養基。繼續培養4h。離心棄上清，加150μL DMSO待充分溶解后，用酶標儀檢測各孔490nm吸光度。每組細胞測3個孔，取平均值，每隔12h檢測1次，連續檢測72 h，繪制細胞生長曲線。

1.2.5 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 用筆在6孔板背后，用直尺比著，均勻地劃橫線，大約每隔0.5～1.0cm 1道，橫穿過孔。每孔至少穿過5條線。每個實驗組均設3個平行樣本。T24細胞以3×106／孔接種于6孔板中，置于37℃、5%CO2培養箱內培養24h，用EZH2－siRNA轉染細胞，再進行培養，24h后更換為無血清培養基培養。當細胞貼壁率為100%時，用比著直尺，垂直畫線。用PBS洗細胞3次，去除劃下的細胞，加入無血清培養基放入37℃5%CO2培養箱繼續培養24h。在光學顯微鏡下觀察劃痕修復過程，取12、24h為時間點拍照記錄。

1.2.6 Transwell細胞小室檢測細胞侵襲能力 收集陰性對照組和干擾2組細胞，用0.25%胰酶消化并制成單細胞懸液。用無血清MEM培養基將 Matrigel配制成10μg／250μL（1∶300）的人工基底膜膠備用。24孔板每孔中鋪 Matrigel 3μg／80μL，放于超凈臺中風干過夜。24孔板每孔加入適量無血清MEM細胞培養液，放置60～90min，洗去多余的膠；取兩組細胞以2×105／孔重懸加入上室內，設3個重復孔，放入37℃、5%CO2培養箱中進行培養。細胞小室，棄去培養液，用PBS洗3遍，洗去未黏附細胞。常規固定染色后光學顯微鏡下計數膜背面侵襲的細胞數量，計數中間和四周共5個視野，每組細胞計數3份，取平均值。

1.2.7 流式細胞術檢測細胞凋亡情況 用不含EDTA的胰酶消化收集培養及轉染24h后的T24細胞，離心、洗滌后加入500μL的Binding Buffer懸浮細胞，接著先加入5μL熒光標記的膜連蛋白V（Annexin V－FITC）混勻后，加入5μL碘化化丙啶（PI），混勻，室溫避光反應5～15min后進行流式細胞儀的檢測。

1.3 統計學處理 采用SPSS10.0軟件進行統計學處理，計量資料以表示，采用方差分析，組間比較采用S－N－K法（q檢驗），檢驗水準α＝0.05，以P＞0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 EZH2－siRNA對EZH2mRNA表達的影響 轉染siRNA下調T24細胞內EZH2mRNA表達，藥物篩選后建立的細胞系經實時熒光定量PCR檢測EZH2的mRNA相對表達量，RT－PCR結果示：空白對照組1.187±0.052、陰性對照組1.192±0.025、干擾1組0.185±0.012、干擾2組0.027±0.009、干擾3組0.157±0.017；3個干擾組細胞EZH2mRNA相對表達均低于空白、陰性對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。陰性對照組與空白對照組相比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。其中，半定量PCR顯示干擾2組效果最好，表達最低，用于后續實驗，由于陰性對照組與空白對照組之間比較差異無統計學意義，所以后續試驗均采用干擾2組與陰性對照組之間比較。見圖1。

圖1 半定量PCR檢測EZH2－siRNA對EZH2mRNA達的影響

圖2 MTT檢測EZH2－siRNA對T24細胞增殖能力的影響

2.2 EZH2表達沉默對T24細胞增殖活性的影響 MTT檢測法結果示：干擾2組細胞從轉染后24h起，細胞增殖速度開始變得緩慢，其明顯慢于陰性對照組，其抑制率分別為36.2%、37.1%、37.9%和30.8%，38.2%，差異均有統計學意義（P＜0.01），見圖2。

圖3 劃痕實驗檢測EZH2－siRNA對T24細胞遷移能力的影響（×200）

2.3 劃痕實驗檢測細胞遷移能力 劃痕實驗結果顯示：劃痕處理24h后，陰性對照組和轉染2組細胞的遷移距離分別為（1.98±0.07）μm和（1.37±0.12）μm。與陰性對照組比較，干擾2組細胞水平運動距離明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖3。

2.4 EZH2表達沉默對T24細胞凋亡的影響 Annexin－v／PI雙染，轉染48h后陰性對照組早、晚期T24細胞凋亡率分別為7.31%和2.49%，而干擾2組為22.8%和3.60%，與陰性對照組比較，干擾2組早期凋亡率差異有統計學意義（P＜0.01），提示EHZ2基因的沉默增加了T24細胞早期凋亡，見圖4。

2.5 EZH2表達沉默對T24細胞基質侵襲能力的影響 Transwell細胞小室檢測細胞侵襲能力結果顯示：光學顯微鏡下觀察計數膜背面干擾2組較陰性對照組侵入細胞數量明顯減少，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖5。

圖4 采用Transwell細胞小室法檢測EZH2－siRNA對T24細胞侵襲能力的影響（×200）

圖5 流式細胞術檢測EZH2－siRNA沉默對T24細胞凋亡的影響

3 討 論

多梳蛋白抑制性復合物2（polycomb repressor complex 2，PRC2）是組蛋白H3第27位賴氨酸特異性的甲基化轉移酶，通過沉默與細胞分化、抑制增殖在內的基因而導致腫瘤的發生，而EZH2是PRC2中起催化作用的核心蛋白，它參與染色質結構的形成、基因表達調節及生長控制，因而具有多潛能性［8－9］。EZH2在PcG和TrxG蛋白復合物的形成、造血細胞發育分化、X染色體滅活、甚至惡性腫瘤形成等過程均具有重要作用。

目前，關于EZH2作為癌基因與惡性腫瘤的發生發展、轉移侵襲能力及預后的相關性已逐漸成為研究的熱點［10］。Wan等［11］定量分析EZH2表達與肺癌的相關性，發現隨著肺癌的發展，EZH2的陽性單位值（PU）逐漸升高，提示在肺癌的發展和轉移過程中，EZH2可能發揮了重要的作用。Hang等［12］發現，EZH2在膀胱上皮癌中普遍高表達，并與其惡性程度呈正相關，表明EZH2基因在膀胱上皮癌的發生、發展中可能起重要作用，據此推測EZH2可作為膀胱癌的一個有效的生物標志物，并可能成為其潛在的治療靶點。

近年來，siRNA沉默基因表達在功能基因組學研究領域中受到越來越多的重視，已被廣泛應用于腫瘤相關基因的功能研究。研究發現在膀胱移行細胞癌中，microRNA－101能直接抑制EZH2的表達而改變染色質的結構，進而減弱腫瘤細胞的增殖能力［13］。Bo等［14］研究認為，microRNA－203能抑制Bcl－w的表達而促進膀胱癌細胞的凋亡，從而減弱細胞的增殖。Guo等［15］發現在膀胱癌細胞中 microRNA－144的表達降低，microRNA－144通過EZH2／Nkd1通路調節 Wnt信號從而抑制EZH2的表達。

本研究通過RNA干擾技術沉默EZH2基因，探討其對膀胱癌T24細胞活性和凋亡的影響。為了明確EZH2表達在T24細胞生物活性過程中的作用，本研究利用基因工程的手段在體外構建人EZH2基因的siRNA的質粒表達載體，并將其轉染入T24細胞，實時熒光定量PCR實驗檢測其對T24細胞EZH2基因表達的沉默效果。檢測結果顯示，3個干擾組細胞EZH2的mRNA表達均低于其他對照組，EZH2表達水平基本被沉默，可構建EZH2基因功能分析的體外實驗細胞模型。

腫瘤細胞的持續分裂與無限增殖能力是腫瘤惡性程度的重要標志。本研究通過細胞增殖實驗分析阻斷EZH2表達后T24細胞增殖能力的變化，MTT檢測結果顯示從轉染后24h起，其抑制率分別為36.2%、37.1%、37.9%、30.8%、38.2%。干擾2組細胞增殖速度明顯慢于陰性對照組，提示EZH2沉默能抑制T24細胞的增殖活性。

腫瘤細胞侵襲力是影響患者預后及生存率的關鍵因素。本研究通過Transwell細胞小室檢測T24細胞侵襲能力的改變。光學顯微鏡下觀察計數膜背面細胞侵入T24細胞的數量，干擾2組較對照組侵入細胞數量明顯減少。提示轉染入EZH2－siRNA的T24細胞的侵襲能力明顯減弱。

遷移在腫瘤細胞轉移過程中也必不可少。腫瘤細胞與母體瘤分離，穿過血管壁、侵襲正常組織，需要一定的運動能力。本法借鑒體外細胞致傷愈合實驗模型測定腫瘤細胞在細胞外基質上的運動特性，結果顯示：劃痕處理24h后，陰性對照組和干擾2組細胞的遷移距離分別為（1.98±0.07）μm和（1.37±0.12）μm。與陰性對照組相比，干擾2組細胞水平運動距離明顯降低。提示轉染入EZH2－siRNA的T24細胞的遷移能力明顯減弱。

為了檢測EZH2基因沉默對T24細胞凋亡的影響，本研究進行了Annexin－v／PI雙染，結果顯示：轉染48h后干擾2組早、晚期T24細胞凋亡率分別為為22.8%和3.60%，較陰性對照組均增加，以早期尤為明顯，表明EHZ2基因沉默能夠增加T24細胞凋亡，提示EZH2可能對于膀胱癌T24細胞存在直接的治療作用新靶點。

綜上所述，EZH2與T24膀胱癌細胞的活性及凋亡密切相關，靶向抑制T24膀胱癌細胞內EZH2表達可抑制T24膀胱癌細胞增殖、侵襲和遷移能力，并促進其凋亡。本研究為深入了解EZH2在T24膀胱癌細胞侵襲和轉移過程中的分子調控機制研究及為EZH2成為T24膀胱癌細胞的潛在分子標志物和靶向治療的新靶點鑒定了基礎。

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