羅格列酮逆轉Burkitt淋巴瘤raji細胞對紫杉醇耐藥的作用及機制

朱紅霞 王保芳 牛保華

Burkitt淋巴瘤是一種比較少見的淋巴造血組織腫瘤，在歐美占兒童淋巴瘤的30%～50%，而散發型Burkitt淋巴瘤在全世界各地均有發生[1]。在Burkitt淋巴瘤的治療方面，盡管高強度，化療方案的改進使Burkitt淋巴瘤治療有了很大的提高，新的化療藥物和治療方案仍有待發現。最近研究認為噻唑烷二酮類(thiazolidinedione，TZD)化合物為過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPAR-γ)配體，可通過激活PPAR-γ發揮誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤增殖和血管生成等作用[2]，但尚未見其對人Burkitt淋巴瘤細胞系作用的報道。本研究旨在研究羅格列酮（Rosiglitazone，RGZ）對人Burkitt淋巴瘤raji紫杉醇耐藥細胞株增殖和凋亡的影響，并探討其逆轉Burkitt淋巴瘤耐藥的作用及機制，為其臨床應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人Burkitt淋巴瘤raji細胞株購自南京凱基生物有限公司。RPMI 1640培養基購自杭州吉諾生物醫藥技術有限公司。小牛血清購自杭州四季青公司。羅格列酮（Rosiglitazone，RGZ）購自葛蘭素史克公司。UA和碘化丙啶(propidium iodide，PI)染料和二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)試劑購自美國Sigma公司；β-actin，P-gp和MRP抗體均購自美國Santa Cruz 。辣根過氧化酶標記物山羊抗小鼠IgG(二抗)和堿性磷酸酶顯色試劑盒購于北京中山生物技術有限公司。RGZ溶于RPMI 1640培養基制成100mmol/L的母液，過濾除菌后-20℃備用。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和耐藥細胞株的建立 raji細胞接種于含10%胎牛血清體積分數的RPMI 1640培養液(pH值7.2～7.4，含100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素)。于37℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫培養箱中傳代培養，取對數生長期細胞用于實驗。

采用逐步間歇藥物濃度遞增法建立紫杉醇耐藥細胞株，歷時172d，藥物濃度從5.0nmol/L 開始逐漸加量，最終獲得了一株能在25nmol/L的TAX含藥培養液穩定生長的raji細胞耐藥細胞株，命名為raji/TAX25。該細胞株能在25nmol/L的TAX含藥培養液穩定生長，持續增殖，對數生長。

1.2.2 細胞計數法檢測RGZ對各組Raj i細胞生長的抑制作用 將細胞分為4組：未加藥的空白對照組，2RGZ組，25nmol/L TAX組及 RGZ+25nmol/L TAX組。取對數生長期的細胞，調整細胞濃度105個細胞/mL接種于24孔板。加入RGZ終濃度為50μmol/L的RPMI 1640完全培養基，設陰性對照和空白對照，每組均設3個復孔。繼續培養24、48、72h。結束培養進行細胞計數。細胞生長抑制率＝(對照組細胞數-給藥組細胞數)/對照組細胞數×100%。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡細胞 收集50μmol/LRGZ作用 48h后的各組raji細胞，每組細胞數至少1×106個細胞，輕輕吹打制備單細胞懸液細胞。懸液細胞移入1.5mL離心管，4℃，500g，離心5min。小心移去上清液，冰預冷PBS洗細胞2次。上流式細胞儀雙染檢測凋亡進行參數獲取和資料分析，計算細胞凋亡率。

1.2.4 蛋白印跡法檢測RGZ對raji細胞P-gp和MRP蛋白表達的影響 收集50μmol/L RGZ作用 48h后的各組raji細胞，提取細胞總蛋白。總蛋白濃度經Bio-Rad測定，SDSPAGE 凝膠電泳分離后轉移至PVDF膜上。加稀釋一抗抗體（靶蛋白抗體）靜置過夜，TBST漂洗，加入二抗孵育，熒光顯色，沖洗。掃描蛋白印跡膠片后觀察結果，按照靶蛋白/β-actin蛋白比例用Scion圖像分析系統（4.02版本）分析條帶影像。

1.3 統計學方法 數據應用SAS 6.12和SPSS13.0統計軟件進行處理。MTT結果采用兩因素方差分析，RT-PCR結果采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 耐藥株raji/TAX25的建立及RGZ對raji細胞紫杉醇耐藥的逆轉作用 raji和raji/TAX25細胞增殖速度接近，倍增時間分別為73.4h和74.8h，表明在產生耐藥性后細胞增殖未受到明顯抑制。RGZ對raji細胞紫杉醇耐藥的逆轉作用，不同組間細胞增值率差異均有統計學意義（F=39.273，P＜0.01）（見圖 1）。

圖1 RGZ對raji細胞紫杉醇耐藥的逆轉作用

2.2 流式細胞儀分析細胞凋亡率 空白對照組的raji和紫杉醇耐藥的raji/TAX25細胞的凋亡率較低，經10μmol/LRGZ作用48h，細胞凋亡率分別增加至(7.07±2.95)和(18.43±5.58)。與對照組(1.32±1.11)和(2.51±1.73)相比，不同時間組間細胞凋亡率差異有統計學意義。表明RGZ對raji細胞耐藥的逆轉可以增加紫杉醇的誘導凋亡作用(F=7.301，P＜0.01)（見圖2）。

圖2 RGZ對各組raji細胞凋亡的影響

2.3 Western蛋白印跡法檢測各細胞P-gp和MRP蛋白表達的變化 raji/TAX25細胞P-gp的表達（0.488±0.122）明顯高于對照組（0.146±0.074）和 RGZ組（0.074±0.086）細胞，經10μmol/LRGZ作用48h降低至（0.198±0.114），不同組間細胞差異有統計學意義(F=8.787，P＜0.01)。raji/TAX25細胞MRP的表達（0.362±0.109）明顯高于對照組（0.09±0.094）和 RGZ組細胞（0.076±0.083），經 10μmol/LRGZ作用48h降低至（0.149±0.089），不同組間細胞差異有統計學意義(F=5.218，P＜0.05)。RGZ對raji細胞紫杉醇耐藥的逆轉作用與下調耐藥相關蛋白P-gp和MRP的表達密切相關（見圖3）。

3 討論

圖3 RGZ對各組raji細胞P-gp和MRP蛋白表達的影響

PPAR-γ是由配體激活的家族，屬II型核受體超家族成員，參與脂肪細胞形成、分化、胰島素敏感、調控細胞周期、抑制炎癥反應等方面生理調節作用[3]。隨著分子生物學技術的發展，研究發現PPAR-γ與多種腫瘤關系密切，在多種腫瘤組織中均有過度表達，對人類腫瘤細胞的增殖及凋亡具有重要的調節作用[4]。RGZ是PPAR-γ合成激動劑。是臨床治療2型糖尿病的主要藥物之一，RGZ是生物利用度最高、藥效最強且其毒副作用相對較小的一種TZDs類藥物[5]。本研究證實，RGZ對人Burkitt淋巴瘤raji紫杉醇耐藥細胞株raji/TAX25細胞有顯著的增殖抑制和誘導凋亡的作用，提示RGZ具有逆轉Burkitt淋巴瘤raji細胞對紫杉醇耐藥的作用。

臨床上腫瘤化療失敗的主要原因是腫瘤細胞對化療藥物產生腫瘤細胞多藥耐藥(multiple drug resistance，MDR)。MDR是指腫瘤細胞在針對一種抗腫瘤藥物產生耐藥性的同時也對結構和作用機制完全不同的其他類型抗腫瘤藥物產生交叉耐藥[6]。因而研究MDR產生的機制并尋求有效的耐藥逆轉劑及逆轉措施來克服腫瘤臨床耐藥，提高化療效果的重要手段已成為國內外的研究熱點。為此本實驗觀察了RGZ對人Burkitt淋巴瘤raji細胞凋亡的影響：流式細胞儀可發現RGZ作用后raji和raji/TAX25細胞的凋亡率高于對照組和耐藥組，進一步證明RGZ可有效逆轉Burkitt淋巴瘤raji細胞對紫杉醇耐藥的作用。

MDR分為兩種表型：天然性耐藥和獲得性耐藥。天然性耐藥是指首次使用化療藥物腫瘤細胞產生的耐藥，而獲得性耐藥則是指在化療過程中腫瘤細胞產生的耐藥[7]。MDR的機制十分復雜，目前認為MDR是多種機制共同作用的結果。MDR產生的分子機制主要包括：跨膜蛋白增加藥物轉運和外排、抗細胞凋亡信號增強、酶系統活性增強等，其中跨膜蛋白增加藥物轉運和外排最為重要，因而研究的也最多。跨膜蛋白主要包括P-糖蛋白(permeability glycoprotein，P-gp)和多藥耐藥相關蛋白(multidrug resistance-associated protein，MRP)，此類蛋白將抗腫瘤藥物從腫瘤細胞中泵出，從而減少其在細胞中聚集而起作用[8-9]。為探討RGZ逆轉Burkitt淋巴瘤raji細胞對紫杉醇耐藥的分子機制，我們觀察了RGZ作用后細胞中耐藥基因P-gp和MRP表達的變化。結果顯示，raji/TAX25組P-gp和MRP表達明顯高于對照組，RGZ作用于后raji/TAX25細胞P-gp和MRP表達的下調，提示RGZ逆轉Burkitt淋巴瘤raji細胞對紫杉醇耐藥的分子機制是通過抑制P-gp和MRP表達來起作用的。

本研究結果認為RGZ能夠抑制人Burkitt淋巴瘤raji細胞的生長，并能誘導腫瘤細胞的凋亡。從這一結論可以看出，RGZ可望成為臨床上治療Burkitt淋巴瘤的有效藥物或輔助用藥。但其作用途徑和機制，尚需進一步研究。另外，應通過體內研究包括動物實驗及臨床研究來進一步探討RGZ對Burkitt淋巴瘤的治療作用。

[1]Miles RR,Arnold S,Cairo MS.Risk factors and treatment of childhood and adolescent Burkitt lymphoma/leukaemia[J].Br J Haematol,2012,156(6):730-743.

[2]Mattos RT,Bosco AA,Nogueira-Machado JA.Rosiglitazone,a PPAR-γ agonist,inhibits VEGF secretion by peripheral blood mononuclear cells and ROS production by human leukocytes[J].Inflamm Res,2012,61(1):37-41.

[3]Christensen KB,Jrgensen M,Kotowska D,et al.Activation of the nuclear receptor PPARγ by metabolites isolated from sage (Salvia officinalis L.)[J].J Ethnopharmacol,2010,32(1):127-133.

[4]Shimazaki N,Togashi N,Hanai M,et al.Anti-tumour activity of CS-7017,a selective peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonist of thiazolidinedione class,in human tumour xenografts and a syngeneic tumour implant model[J].Eur J Cancer,2008,44(12):1734-1743.

[5]Rizzo A,Spedicato M,Cosola C,et al.Effects of rosiglitazone,a PPAR-gamma agonist,on the contractility of bovine uterus in vitro[J].J Vet Pharmacol Ther,2009,32(6):548-551.

[6]Sui H,Fan ZZ,Li Q.Signal Transduction Pathways and Transcriptional Mechanisms of ABCB1/Pgp-mediated Multiple Drug Resistance in Human Cancer Cells[J].J Int Med Res,2012,40(2):426-435.

[7]Steiner E,Holzmann K,Elbling L,et al.Cellular functions of vaults and their involvement in multidrug resistance[J].Curr Drug Targets,2006,7(8):923-934.

[8]Brillault J,De Castro WV,Harnois T,et al.P-glycoprotein-mediated transport of moxifloxacin in a Calu-3 lung epithelial cell model[J].Antimicrob Agents Chemother,2009,53(4):1457-1462.

[9]Weso!owska O.Interaction of phenothiazines,stilbenes and flavonoids with multidrug resistance-associated transporters,P-glycoprotein and MRP1[J].Acta Biochim Pol,2011,58(4):433-448.