復方中藥制劑對砷暴露大鼠肝臟損傷的保護研究

王一帆 程明亮 吳君

目前動物實驗和人群流行病學調查表明砷對肝臟有致損傷作用，可引起多種肝臟疾病（肝纖維化、肝硬化及肝癌）[1-2]。且臨床觀察漢丹肝樂對砷中毒致肝損傷有保護作用，初步顯示較好療效[3]。本實驗研究漢丹肝樂對砷暴露大鼠肝損傷的保護作用，了解其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物為SD大鼠80只，雌雄各半，體重（180～200）g，由貴陽醫學院實驗動物中心提供。SD大鼠隨機分成正常組、模型組、漢丹肝樂高、低劑量預防組，每組各20只。

試劑采用漢丹肝樂（主要成分丹參、赤芍、黃芪、漢防己堿、銀杏葉等），棕黃色粉末，貴陽制藥廠生產。亞砷酸鈉，分析純，美國sigma公司產品。丙二醛測定試劑盒、超氧化物歧化酶測定試劑盒、Trizol試劑均購于南京建成生物工程研究所。MT引物由上海生工生物工程有限公司合成。β-actin引物、逆轉錄cDNA第一鏈合成試劑盒、POWER SYBR Green PCR MASTER MIX由美國國家環境衛生科學研究所劉杰博士惠贈。甲醛、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等均為市售分析純。實驗器材采用GeneAmp9700擴增儀、GeneAmp5700實時熒光定量基因擴增儀、Amersham Biosciences 2100核酸蛋白分析儀、SIGMA-3K30臺式冷凍離心機、上海菁華科技儀器有限公司752紫外可見分光光度計、日本三洋-80℃低溫冰箱、水浴箱、低速離心機、微波爐等。

1.2 方法 正常組大鼠飲用自來水，模型組、漢丹肝樂高、低劑量預防組飲用亞砷酸鈉水，食用普通飼料。亞砷酸鈉水濃度，在實驗前根據給藥方式、大鼠耐受情況，用不同濃度給大鼠飲用，最后選定100/L作為實驗濃度。同時，用漢丹肝樂懸液給預防組大鼠灌胃，1次/d，高劑量預防組1g/kg體重、低劑量預防組0.5 g/kg體重。4周后每組大鼠隨機處死10只，取肝組織-80℃保存。12周后處死剩余大鼠并留取標本（模型組、漢丹肝樂低劑量預防組各死亡2只）。

1.3 檢測指標 按照相應測定試劑盒說明書操作檢測肝組織勻漿MDA、SOD;抗氧化系統功能檢測;Real-Time quantitative RT-PCR檢測MT基因的表達。

1.4 統計學方法 使用SPSS11.5統計軟件，計量資料以均數±標準差（）表示，組間比較采用方差分析，分析前行方差齊性檢驗，方差齊時用LSD法，若方差不齊時用Tambane’s 法（q’檢驗），P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 漢丹肝樂預防4周、12周時，各實驗組大鼠抗氧化系統受藥物的影響如表1、表2所示，漢丹肝樂預防4周，模型組和預防組大鼠肝臟MDA含量與正常組比較有所增加，SOD活性有所減少，但差異無統計學意義（F值分別為1.475,0.228）。漢丹肝樂預防12周，低劑量預防組、模型組大鼠肝臟MDA含量較正常組明顯增加（F=5.449，P<0.05），SOD活性明顯減少（F=5.432，P<0.05），差異有統計學意義。高劑量預防組大鼠肝臟MDA含量較模型組明顯降低（F=5.449，P<0.05），SOD活性明顯增加（F=5.432，P<0.05），差異有統計學意義。

表1 第4周各組大鼠肝臟MDA、SOD的變化()

表1 第4周各組大鼠肝臟MDA、SOD的變化()

注：與正常組比較，aP>0.05

組別 例數 MDA（nmol/mgprot） SOD(U/mgprot)正常組 10 2.024±0.634 338.720±49.076模型組 10 2.291±3.028a 322.307±3.028a高劑量預防組 10 2.109±0.824a 312.623±46.092a低劑量預防組 10 2.568±1.091a 332.046±77.858a

表2 第12周各組大鼠肝臟MDA、SOD的變化()

表2 第12周各組大鼠肝臟MDA、SOD的變化()

注：與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

組別 例數 MDA（nmol/mgprot） SOD(U/mgprot)正常組 10 2.16±0.394 374.684±38.732模型組 8 4.551±2.672a 280.844±30.537a高劑量預防組 10 2.163±0.284b 343.38±52.740b低劑量預防組 8 3.759±0.790a 318.35±58.241a

2.2 漢丹肝樂預防4周、12周時，藥物對大鼠肝臟MT mRNA表達的影響 如表3、表4所示，漢丹肝樂預防4周和12周,模型組和低劑量預防組大鼠MT-mRNA表達較正常組明顯減少，差異有統計學意義（F值分別為16.495，19.917,P<0.05）。高劑量預防組大鼠MT-mRNA表達較模型組顯增加，差異有統計學意義（F值分別為 16.495，19.917,P<0.05）。

表3 第4周漢丹肝樂對各組大鼠肝臟MT mRNA表達的影響()

表3 第4周漢丹肝樂對各組大鼠肝臟MT mRNA表達的影響()

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 例數 MT mRNA的相對表達水平正常組 10 91.77±3.67模型組 10 81.17±2.22a高劑量預防組 10 89.75±2.36b低劑量預防組 10 83.23±3.69a

表4 第12周漢丹肝樂對各組大鼠肝臟MT mRNA表達的影響()

表4 第12周漢丹肝樂對各組大鼠肝臟MT mRNA表達的影響()

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05

組別 例數 MT-mRNA的相對表達水平正常組 10 80.09±2.27模型組 8 69.6±6.37a高劑量預防組 10 78.18±2.15b低劑量預防組 8 73.43±4.38a

3 討論

以往研究表明砷有致肝損傷作用。漢丹肝樂通過減少膠原合成及貯脂細胞增殖，抑制脂質過氧化，減輕炎癥反應，調節免疫等作用，從而保護肝細胞[4-8]。此實驗想了解漢丹肝樂對砷暴露大鼠肝損傷的保護作用，探討藥物保護肝損傷的可能機制。

有研究發現氧化與抗氧化系統參與多種因素（CCL4、砷等）引起的肝損傷[9-10]。砷在體內可以促進自由基的生成，使膜脂質發生過氧化反應，破壞膜結構，從而導致細胞死亡，組織損傷。而當體內自由基增加時，機體會動員抗氧化物質來清除自由基，這樣就使得體內的抗氧化物質減少，抗氧化酶活性減低。砷對該系統的影響就是打破了機體氧化與抗氧化系統的平衡。在實驗中漢丹肝樂預防4周，高、低劑量預防組MDA含量、SOD活性與模型組比較無明顯差異，預防12周高劑量預防組MDA含量較模型組明顯減少，SOD活性明顯增加，低劑量預防組與模型組比較MDA含量有所減少，SOD活性有所增加但不明顯，提示漢丹肝樂對砷暴露大鼠所致的氧化損傷有拮抗作用，此作用可能是通過藥物干預氧化與抗氧化系統而產生的。且高劑量預防組表現出的拮抗氧化損傷的作用趨勢更大。

金屬硫蛋白是一類金屬含量高（通常4～12個金屬離子/分子）、富含半胱氨酸（20%～30%，有豐富的Cys－X－Cys序列結構域）、缺乏芳香族氨基酸、組氨酸含量極少的低分子量（6000～7000D）金屬結合蛋白。研究[11-14]發現MT清除羥自由基的作用是體內目前已知最強的，對肝細胞具有一定的保護作用。實驗中我們發現漢丹肝樂預防4周、12周模型組的MT-mRNA表達較正常組明顯降低，表明MT可能參與了砷致大鼠肝損傷的過程，有研究[15]顯示MT表達的降低可能是亞砷酸鈉肝毒性的一個易感因素。低劑量預防組MT-mRNA表達較正常組明顯降低，高劑量預防組MT-mRNA表達與正常組水平相當，與模型組比較明顯增高，提示高劑量的漢丹肝樂可顯著誘導砷暴露大鼠肝臟表達MT-mRNA。MT表達缺乏后，肝臟對化學藥物、金屬毒物所致肝毒性的敏感性增高，MT表達增多的轉基因鼠則可對抗這種肝毒性，提示MT對肝細胞的保護作用[11-14]。漢丹肝樂誘導MT表達后，可能由于MT能有效的減輕肝臟的脂質過氧化反應，減少炎癥細胞浸潤，炎癥介質的釋放，干預了肝損傷的發生。

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