4-1BBL在淋巴瘤組織中的表達及其臨床意義

姜文國 張樹平 董秀紅 楊 茗 亢澤春

本研究選取80例淋巴瘤病例，包括非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma，NHL)病例70例，霍奇金病(hodgkin’s disease，HD)10例，利用不同的4-1BBL抗體，在蛋白水平檢測了4-1BBL的表達轉(zhuǎn)變?yōu)閟4-1BBL(soluble 4-1BB ligand)的情況，并結(jié)合患者基本情況分析4-1BBL轉(zhuǎn)變與疾病進展和類型的關系。

1 材料與方法

1.1 淋巴瘤病例組織芯片

淋巴瘤組織芯片(NHL803)購自西安艾麗娜生物科技有限公司，含70例非霍奇金淋巴瘤，包括彌漫型B細胞淋巴瘤44例，結(jié)節(jié)-彌漫型B細胞性淋巴瘤6例，B細胞性黏膜相關性淋巴瘤、濾泡型非霍奇金淋巴瘤各3例，淋巴漿細胞樣淋巴瘤2例，Burkitt樣淋巴瘤、濾泡中心細胞性非霍奇金淋巴瘤、外套細胞淋巴瘤、淋巴母細胞性T細胞性淋巴瘤、T細胞性淋巴瘤、彌漫型透明T細胞淋巴瘤、Lennert淋巴瘤各1例，間變性大細胞淋巴瘤5例；10例霍奇金病。所有的組織在采集的時候都遵循最高的道德標準，將全部的信息都告知捐獻者，并征得他們的同意。

1.2 主要抗體和試劑

檢測4-1BBL C端的抗體(sc-11817)購自SANTA CRUZ公司，檢測4-1BBL N端的抗體(2305-1)購自Abcam公司；利妥昔單抗(Rituximab，美羅華)購自上海羅氏公司；辣根過氧化物酶標記的抗羊、抗兔和抗人抗體HRP-IgG、濃縮型DAB試劑盒均為北京中杉金橋公司產(chǎn)品。

1.3 免疫組織化學染色分析

將組織芯片于60℃烤箱中烘烤2 h。然后二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化；3% H2O2室溫孵育 5～10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；抗原熱修復；5%的牛血清白蛋白(BSA)封閉；沖洗后加入利妥昔單抗以及2種4-1BBL抗體孵育過夜；沖洗后分別加入抗人、抗兔和抗羊抗體HRP-IgG；然后采用中杉公司DAB顯色試劑盒顯色，蘇木精復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在光鏡下，陽性細胞顯示出棕褐色，Leica顯微鏡低倍鏡下照相保存結(jié)果[1]。

1.4 結(jié)果判斷

相同光照條件、相同放大倍數(shù)下，每個組織均單獨保留1張全組織的照相結(jié)果。免疫組化照片應用Image-Pro Plus 6.0軟件中的Pathology批處理程序，分別對4-1BBL N端和C端的抗體對淋巴瘤組織的結(jié)合情況進行計算累計光密度值(integrated optical density，IOD)，結(jié)合鏡下照片確立陽性和陰性標準(IOD值超過500萬為陽性)，并結(jié)合患者臨床資料進行統(tǒng)計分析[2-3]。因為每個組織芯片的面積基本一致，故相關性分析根據(jù)具體IOD值按計量資料進行統(tǒng)計分析。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 CD20抗原在淋巴瘤組織中表達情況

排除在實驗過程中脫落后不完整的2例組織，余78例有效淋巴瘤，經(jīng)軟件分析，結(jié)合免疫組化切片染色情況，設立淋巴瘤組織芯片累計光密度值500萬為分界線，超過500萬者為陽性。淋巴瘤病例組織中，CD20表達陽性占66.7%。淋巴瘤組織中CD20陽性率與患者年齡及性別無顯著相關性；與腫瘤病理類型相關， HD患者CD20抗原的表達水平顯著高于NHL患者(表1)。

2.2 4-1BBL在淋巴瘤組織中的表達情況

采用N端抗體檢測的是總4-1BBL的表達水平，而C端抗體主要檢測膜結(jié)合型4-1BBL的表達水平，故總體IOD值N端測定組大于C端測定組。結(jié)果表明，4-1BBL表達水平與患者年齡、性別及病理類型等無顯著相關性，只是HD患者N端4-1BBL表達水平較NHL患者略高(表2)。另外，對同一組織，采用2種不同抗體分別測定4-1BBL的 IOD值，發(fā)現(xiàn)兩者IOD值并無顯著相關性(P>0.05)。這說明不同的患者4-1BBL轉(zhuǎn)變?yōu)閟4-1BBL的比率是隨機的。

表1 組織芯片分析CD20抗原在淋巴瘤組織中的表達情況

表2 組織芯片分析4-1BBL抗原在淋巴瘤組織中表達情況

3 討論

CD20表面抗原分子量約為35 kD的，是B淋巴細胞表面特有的分化抗原，它參與了B細胞的增殖、分化、信號轉(zhuǎn)導和鈣離子的跨膜傳遞等多種功能。它表達于90%以上的B淋巴瘤細胞和正常B淋巴細胞，在造血干細胞、原始B淋巴細胞、正常血細胞以及其他組織上不表達。CD20分子具有不易脫落、與抗體結(jié)合后不內(nèi)化、在人體血清中無游離形式存在等特征。因此，作為治療B 細胞淋巴瘤的理想作用靶點受到了人們的關注。自1997年利妥昔單抗(Rituximab，美羅華)批準上市至今，抗CD20治療性單克隆抗體發(fā)展迅速。現(xiàn)在臨床上有多種以CD20抗原為靶點的藥物[4]。

本研究中采用利妥昔單抗作為陽性對照測定淋巴瘤患者組織細胞表面CD20抗原的水平，可以在免疫組化染色分析實驗中保證操作的規(guī)范性。另外，結(jié)果中我們發(fā)現(xiàn)，CD20在淋巴瘤組織的陽性率與病理類型相關，在HD患者，CD20抗原的表達顯著高于NHL患者。當然，國外也有報道，利妥昔單抗在治療淋巴細胞為主性霍奇金病(lymphocyte predominance Hodgkin’s disease，LPHD)中有一定療效，本研究中的10例HD，其中有4例是LPHD。很多治療經(jīng)驗也表明對于CD20表達陽性的HD患者，利妥昔單抗是有效的。最近研究也表明，在HD患者的化療，尤其是應用抗CD20抗體進行治療方面，其R-S細胞CD20抗原的表達水平具有指導意義[5]。

s4-1BBL(soluble 4-1BB ligand) 是4-1BBL的可溶性形式，可以檢測到幾種不同分子量的s4-1BBL。有研究表明： s4-1BBL也是有活性的，在有固定的抗-CD3存在時，它能夠傳遞協(xié)同刺激信號給外周T細胞。就目前的研究結(jié)果看，產(chǎn)生s4-1BBL至少存在2種機制。第一，體外研究發(fā)現(xiàn)，應用基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(matrix metalloproteinase inhibitor，MMPI )能部分阻斷因細胞激活導致的s4-1BBL的釋放，明顯減少s4-1BBL的水平，從而增加細胞膜表面的4-1BBL，這說明s4-1BBL可能是由基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP )切割產(chǎn)生的[6]。第二，通過選擇性剪接，4-1BBL缺失跨膜區(qū)直接轉(zhuǎn)變?yōu)閟4-1BBL，釋放出來[7]。2種方式，都造成其逃脫了宿主淋巴細胞的免疫監(jiān)視，并且減少通過4-1BBL作用到腫瘤細胞的凋亡信號。本研究中發(fā)現(xiàn)，采用N端和C端2種抗體測定4-1BBL表達水平，發(fā)現(xiàn)兩者并無顯著相關性。這說明在不同的患者，4-1BBL轉(zhuǎn)變?yōu)閟4-1BBL的比率是不同的。

另外，在研究我們使用了Image-Pro Plus 6.0軟件中的Pathology批處理程序?qū)M織芯片染色結(jié)果進行計算量化處理。應用這種計算機輔助的圖像分析程序，能很大程度上避免鏡下觀察染色結(jié)果的主觀傾向性，結(jié)果更加可靠和準確。同時因為組織芯片面積非常一致，也非常適合采用Pathology批處理程序快速計算IOD值，省時省力。通過IOD值的比較也能夠獲得較手工統(tǒng)計更多的生物學信息[8]。本研究發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)病例， N端測定組IOD值顯著大于C端測定組，說明很多s4-1BBL是通過MMP直接切割導致的；另外也有部分病例兩者差別不大，或者結(jié)果正好相反C端測定組IOD值顯著大于N端測定組，這說明也有部分s4-1BBL是直接表達出來轉(zhuǎn)運到細胞外的。綜上所述，我們進一步明確了s4-1BBL的產(chǎn)生機制，為淋巴瘤的免疫治療提供了重要的指導。

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