索拉非尼聯合順鉑抑制人肺癌裸鼠移植瘤生長的療效研究

鄭 航 崔彥芝 陳逢生

索拉非尼最初是在對c-RAF激酶的抑制劑先導物進行結構-活性評價的生化分析中被發現的，其對c-RAF、野生型和突變型b-RAF有強效的抑制作用，直接抑制腫瘤細胞的生長，還能抑制人VEGFR-2和小鼠VEGFR-2、VEGFR-3、PDGFR-β、FLT3和c-KIT的酪氨酸激酶活性，阻斷腫瘤新生血管的形成和切斷腫瘤細胞的營養供應，間接地抑制腫瘤細胞的生長，有雙重抗腫瘤作用[1-2]。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是發病率和病死率都很高的惡性腫瘤，目前化療使晚期NSCLC的病死風險下降尚不足30%；對于放化療失敗的NSCLC患者，尚缺乏有效手段控制其病情進展。因此，有必要尋找和開發新的藥物，近年來興起的分子靶向治療藥物日益引起重視。本研究通過觀察索拉非尼聯合順鉑對肺癌A549細胞裸鼠移植瘤的抑制效果及對裸鼠免疫功能的影響，為索拉非尼治療肺癌的臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 藥物、動物與細胞株

索拉非尼片劑為拜耳制藥公司產品。順鉑注射液為連云港豪森制藥生產。

4～5 周齡的 BALB/c(nu/nu)裸小鼠 50 只，SPF級，雌雄各半，由廣州中醫藥大學動物實驗中心提供。A549肺癌細胞株來源于本中心。

1.2 人肺癌 A549裸鼠移植瘤模型的建立及治療實驗分組

人肺癌A549細胞懸液(含活細胞5×106/ml)接種于裸鼠右腋皮下，每只裸鼠注射0.2 ml。將成瘤小鼠(瘤重達120～140 mg)隨機分成空白對照組、溶劑對照組、索拉非尼組、順鉑組和聯合用藥組共5組，每組10只。索拉非尼組給予索拉非尼30 mg/kg，胃管灌入0.1 ml，每天1次，共12 d；腹腔注射生理鹽水0.2 ml，每4 d 1次，共3次；順鉑組給予順鉑5 mg/kg，腹腔注射0.2 ml，每4 d 1次，共3次，生理鹽水0.1 ml胃管灌入，每天1次，共12 d。聯合用藥組給予索拉非尼30 mg/kg，順鉑5 mg/kg，2種藥物于同一天開始給藥，早上給予索拉非尼，下午給予順鉑，時間間隔3～5 h。而溶劑對照組給予稀釋至與索拉非尼組相同濃度的溶劑0.1 ml，腹腔注射0.2 ml生理鹽水，時間同上述。空白對照組按上述給藥方式及時間給予生理鹽水腹腔注射或胃管灌入。

1.3 裸鼠體重及瘤重的測定

給藥第1天開始測體重和瘤重，每周測2次。應用游標卡尺測量腫瘤長徑(a)及短徑(b)；瘤體積根據以下公式計算：瘤重=(a×b2)/2，繪制皮下腫瘤生長曲線。

1.4 療效及毒性評價

療效評價以治療后腫瘤體積增長至治療前2倍所需的時間，用T2表示。療效以完全緩解(complete remission，CR)、部分緩解(partial remission，PR)和腫瘤生長延遲時間(tumor growth delay，TGD)來評價：肉眼皮下腫瘤完全消失至少超過5 d為CR；腫瘤體積縮小在50%～100%間，并至少持續5 d為PR；TGD指處理組T2與空白對照組T2的差值。毒性評價：以超過20%裸鼠死亡和(或)體重(去除瘤重)減輕超過20%為毒性標準。

1.5 統計學處理

2 結果

2.1 索拉非尼、順鉑單藥和聯合用藥對人肺癌 A549移植瘤的治療效應

聯合用藥組腫瘤生長較其余4組均慢，表明聯合用藥組抑制腫瘤生長效果優于索拉非尼及順鉑單藥組。治療后第25天空白對照組和溶劑對照組腫瘤瘤體積比較無顯著性差異(P=0.072)，聯合用藥組腫瘤瘤體積小于索拉非尼及順鉑單藥組(P<0.01)，見圖1。

各治療組與對照組相比，T2明顯延長(P<0.01)；聯合用藥組T2(29.05 d)長于索拉非尼(19.31 d)和順鉑組(21.22 d)。聯合用藥組TGD較索拉非尼(8.53 d)及順鉑單藥組(9.72 d)長，達16.73 d，見表1。

2.2 索拉非尼、順鉑單藥和聯合用藥對人肺癌 A549移植瘤的安全性和毒性

各治療組耐受性良好，每組均病死率均示超過20%，體重減少亦未超過20%。溶劑對照組、順鉑組、索拉非尼組及聯合用藥組各死亡1只。各組均無CR，其中索拉非尼單藥組及聯合用藥組各有1只PR，見表2。

圖1 索拉非尼、順鉑單藥及聯合用藥對人肺癌 A549細胞移植瘤模型瘤體積的影響

組別 T2/dTGD/d空白對照組11.75±2.83 0溶劑對照組10.91±3.02-0.84Sorafenib組20.28±2.03? 8.53DDP組21.47±3.87? 9.72Sorafenib+DDP組28.48±4.35?#△ 16.73

注：*為與對照組比較P<0.05；△為與Sorafenib組比較P<0.05；#為與DDP組比較P<0.05；T2為腫瘤增長至治療前瘤體積2倍所需的時間；TGD為腫瘤生長延遲時間。

表2 索拉非尼、順鉑單藥及聯合用藥對人肺癌 A549細胞移植瘤裸鼠的療效和毒性

注：* 為去除瘤重的體重。

3 討論

對于晚期難治性肺癌病例，徹底根治的機會很小，而延長生存期、提高生活質量則成為更為重要的目標。索拉非尼聯合化療藥物方案可以是很多晚期實體瘤有價值的治療方案選擇之一。本實驗通過索拉非尼聯合順鉑在人肺癌移植瘤模型中的研究，觀察兩藥聯合的安全性及抗腫瘤活性，為臨床的應用提供一定的試驗依據。

研究[1-2]顯示，索拉非尼每日1次口服對人腫瘤的動物移植模型了廣泛的抗腫瘤活性，如小鼠非小細胞肺癌模型NCI-H460、NCI-H23和A549，結腸癌模型HT-29、DLD-1、HCT-116和Colo-205，乳腺癌模型MDA-MB-231、胰腺癌模型Mia-Paca-2等，腫瘤的生長抑制率為30%～94%。與紫杉醇、伊立替康、吉西他濱和順鉑等聯合應用后抗腫瘤作用增強，而毒副作用不增強[3-4]。 Carter等[5]在NCI-H460模型中，應用長春瑞濱(6.7 mg/kg)和索拉非尼(40 mg/kg)治療后，單藥TGD分別為2.4 d和7.8 d，聯合用藥TGD達10.0 d，且毒副作用不增強；而在NCI-H23模型中，高劑量索拉非尼聯合順鉑耐受性良好，療效與順鉑單藥相仿，但低劑量兩藥聯合產生相加的作用，療效優于單藥或至少和單藥相似[5]。達卡巴嗪(DTIC)聯合或不聯合索拉非尼作為一線方案治療晚期黑色素瘤患的Ⅱ期隨機研究結果顯示[6]，索拉非尼+DTIC組較安慰劑+DTIC 組的中位TTP顯著延長(21.1 周對11.7 周，RR 為0.619，P=0.039)；兩組最佳應答率(ORR：CR+PR)、疾病控制率分別為24% vs 12%和71% vs 56%；兩組6個月和9個月PFS率分別為41% vs 20%和22% vs 12%。本實驗結果顯示，根據瘤重增長曲線，索拉非尼和順鉑無論單藥還是聯合，均顯示出抗腫瘤活性，而聯合用藥腫瘤生長比單藥更慢。索拉非尼單藥組和順鉑單藥組的TGD分別為8.53 d和9.72 d，聯合用藥組出現了更長的TGD，達16.73 d。索拉非尼聯合順鉑在裸鼠A549細胞移植瘤模型中顯示出了增強的抗腫瘤效應。與上述結果一致。

臨床試驗顯示[7]，索拉非尼聯合化療藥物在多種進展期實體瘤包括RCC、黑色素瘤、HCC和結腸癌中，取得優于單藥甚至相加的作用，聯合治療的疾病控制率達79%，而且具有較好的安全性和耐受性，聯合應用的安全性和耐受性與臨床前研究的結果相一致[3-4]。其主要不良反應是手足綜合征、皮疹、腹瀉和疲乏，這些不良反應多為暫時性的輕度、中度反應，經對癥處理可恢復正常。本研究中，溶劑對照組、順鉑組及聯合用藥組各有1只裸鼠死亡，索拉非尼組有1只死亡，其中溶劑對照組、索拉非尼組及聯合組裸鼠死亡為灌胃操作不當引起。順鉑組死亡裸鼠解剖后未發現明顯的腫瘤轉移及淋巴結腫大，考慮藥物毒性所致。各組裸鼠死亡率及體重減輕均未超過20%，提示聯合用藥組亦未出現比單藥更強的毒性，該濃度索拉非尼和順鉑兩藥聯用是安全、能耐受的。

索拉非尼在體外試驗中可誘導多種腫瘤細胞的Bcl-2家族成員Mcl-1下調[8]，而抗凋亡分子(如Bcl-2)的過表達可能是化療藥物的耐藥機制之一[9]。最近的證據顯示，Bcl-2 和C-Raf可協同抑制凋亡[9]，Raf可以上調多藥耐藥基因(mdr-1)的表達[10]，因此，或許可以通過Raf抑制劑如索拉非尼來減低化療藥物的耐藥性。研究發現，對單藥化療抵抗的腫瘤與索拉非尼聯用時顯示出了增強的抗腫瘤效應，提示了索拉非尼可能增強這些化療藥的敏感性。比如，索拉非尼聯合奧沙利鉑治療奧沙利鉑無效的結腸癌患者仍可使疾病得到穩定；對紫杉類、鉑類及蒽環類抵抗的卵巢癌患者接受索拉非尼聯合吉西它濱治療仍可出現PR[11]。吉西它濱治療無效的鼻咽癌患者聯合索拉非尼后SD仍可超過1年[11]。這些結果與臨床前研究喲一致性，其機制值得我們深入研究。

總之，索拉非尼及順鉑聯合用藥對人肺癌 A549裸鼠移植瘤模型顯示出了增強的抗腫瘤效應。兩藥在該劑量水平聯合具有較好的安全性和耐受性。隨著對生物化療這一模式研究的深入，無論是臨床前還是臨床試驗，越來越多的聯合方案及實體腫瘤被納入研究中。索拉非尼聯合化療藥物這種生物化療方案逐漸成為研究熱點，但其內在聯合機制仍未明確，有待進一步探討。

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