不同年齡大鼠消化道Cajal細胞c-kit受體表達的變化及意義

李 永 王進海 秦 燕 鄒百倉

(西安交通大學第二醫院消化科，陜西 西安 710004)

國內外的一系列流行病學調查報告顯示在成年人中，功能性便秘具有較高的發病率，而在65歲以后的老齡人群中，其發病率更是顯著升高〔1～4〕。胃腸Cajal間質細胞(ICC)是消化道運動的起搏細胞，產生和傳播胃腸道慢波節律，形成胃腸道平滑肌的節律性收縮，對胃腸運動具有重要的作用。本研究擬探討生理性衰老過程中胃腸運動功能的變化及其在老年人功能性胃腸疾病發生的機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物分組 選用清潔I級不同年齡的雄性SD大鼠80只(成都天碩動物繁殖基地提供)按年齡分為3月齡組(青年組)、9月齡組(壯年組)、18月齡組(壯年組)、24月齡組以及30月齡(后兩組均為老齡組)5組，分別相當于人的14、22.5、45、60和75歲，每組16只。將動物購買后在安靜環境下飼養7 d。所有動物均給予普通飼料，自由飲水。

1.2取材 每組大鼠隨機選取8只處死后開腹截取胃體、空腸、回腸、結腸、乙狀結腸與直腸交界(簡稱交界)部位標本，放入4%多聚甲醛液中過夜，20%蔗糖過夜脫水，液氮中放置1 min，然后放入-80℃冰箱備用。將冰凍標本切片，片厚8 μm。

1.3免疫組化染色 嚴格按照免疫組化SABC染色法。0.01 mol/L檸檬酸鈉溶液修復抗原；0.5%Triton液處理30 min；3%過氧化氫室溫孵育30 min，以消除內源性過氧化物酶的活性；5%羊血清封閉20 min，加入兔抗鼠c-kit受體多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，37℃ 1 h后4℃冰箱過夜；加入生物素標記羊抗兔二抗，37℃ 40 min ；加入(濃縮型SABC免疫組化染色試劑盒購自中國武漢博士德生物工程有限公司)，37℃ 40 min；DAB顯色(DAB顯色試劑盒購自中國武漢博士德生物工程有限公司)，部分復染，封片，顯微鏡下觀察并拍照。陰性對照以PBS代替相應一抗。

1.4圖像采集和分析 胃腸壁環、縱肌層出現細胞胞漿棕黃色為c-kit受體染色陽性反應。每張切片選取5個高倍鏡視野(400倍)，應用Image Pro Plus軟件進行掃描分析，根據公式：陽性表達積分光密度=(陽性表達平均光密度-背景平均光密度)×陽性表達面積，計算陽性表達積分光密度，取其平均值。

1.5腸道推進率檢測〔5〕每組大鼠隨機選取8只禁食24 h，按5 ml/kg比例用灌胃針將印度墨汁灌入大鼠胃，30 min后處死大鼠并立即開腹取全胃腸，量取幽門括約肌至墨汁最前端距離及全腸道長度，以兩者之比為腸道推進率。

2 結 果

2.1c-kit受體陽性表達 如圖1、圖2所示，在大鼠的胃體、空場、回腸、結腸以及結腸與直腸交界5個部位c-kit受體陽性細胞的胞體較大，呈圓形、紡錘狀或不規則形，每個細胞均有數個不規則突起。在未HE染色的條件下，c-kit受體陽性細胞呈團簇狀連續或間斷的分布于大鼠消化道的肌層，主要分布于環、縱肌層之間，與環肌層平滑肌平行。與3月齡組、9月齡組和18月齡組大鼠相比，老年大鼠(24月齡和30月齡)肌間ICC c-kit受體表達顯著下調，其中以乙狀結腸與直腸交界處變化最為顯著(P<0.05)，見表1。

2.2腸道推進率 大鼠腸道推進率從3月齡的(67.2±13.5)%逐漸減少到30月齡的(52.1±9.8)%(P<0.01)。與3月齡、9月齡(65.7±14.2)%及18月齡(62.9±12.3)%大鼠比較，24月齡(57.2±10.7)%和30月齡大鼠腸道推進率顯著降低(P<0.05，P<0.01)。

表1 不同年齡組不同部位c-kit受體陽性積分光密度

胃體

空腸

回腸

結腸

乙狀結腸

胃體

空腸

回腸

結腸

乙狀結腸

3 討 論

約30%～40%老年人均有不同程度的胃腸動力異常，表現為食管括約肌功能障礙，胃排空延遲，小腸通過延長，腸道運動頻率降低，結腸傳遞時間顯著延長，并且在體外對膽堿能和電刺激的敏感性下降，其便秘、功能性消化不良等疾病的發生率亦增高。但目前臨床上對人體胃腸動力與年齡老化相關的改變尚認識不足。本實驗結果提示，在大鼠生理性衰老過程中，腸道推進率隨年齡增長逐漸降低。

ICC是消化道運動的起搏細胞，產生和傳播胃腸道慢波節律，形成胃腸道平滑肌的節律性收縮。同時ICC細胞與腸神經系統中的神經元細胞及消化道平滑肌細胞存在著緊密的連接，是腸神經元向平滑肌細胞傳導神經沖動的中介結構和功能單位。目前國內外的一系列研究顯示消化道ICC數量、分布以及結構的異常可以造成胃腸慢波節律的異常以及腸神經元與平滑肌細胞之間沖動傳導的障礙，進一步則可以導致胃腸運動功能障礙，從而引起胃食管反流、胃輕癱、慢性假性腸梗阻及慢傳輸型便秘、賁門失弛緩癥、嬰兒肥厚性幽門狹窄，嬰兒特發性胃穿孔、先天性腸閉鎖、先天性巨結腸及肛門直腸畸形及肛門內括約肌弛緩不能〔6～9〕。間葉ICC前體表達c-kit受體，c-kit受體細胞外區域含SCF結合位點，在不同來源的kit的作用下間葉ICC前體可分化成兩類ICC：肌間ICC(ICC-MY)和肌肉ICC(ICC-IM)。當編碼kit或SCF的基因位點發生突變、kit信號途徑受損后，ICC增生和分化受到影響。在動物實驗中，Torihashi等〔10〕證實在出生后第8天的腸肌叢ICC培養液中加入抗c-kit受體單抗ACK2后，ICC最終不能發育成熟，并再腸肌叢消失，并且用中和抗體封閉了c-kit受體后，可導致成熟ICC再分化呈平滑肌細胞樣表型。W位點的變異可完全或部分的阻斷c-kit蛋白的表達，引起胃腸平滑肌電和機械活動的異常。Isozaki等〔11〕用原位雜交方法顯示+/+對照大鼠胃肌間神經叢c-kit 受體mRNA表達的ICC分布均勻，而在所有Ws/Ws大鼠均未檢測到c-kit Mrna；在+/+對照大鼠小腸，c-kit mRNA陽性的ICC線性分布于肌間神經絲和接近黏膜下的神經叢，在Ws/Ws大鼠小腸僅有少量ICC分布。Ordog等〔12〕將剛出生的小鼠胃與kit中和抗體ACK2共同孵育，14～48 d后，7塊組織的kit陽性細胞完全消失，另7塊組織孵育9～41 d后，kit陽性細胞在局部組織仍存在，但染色淡。這都說明了kit-SCF系統對ICC發育的重要作用。因此通過檢測消化道ICC表達c-kit受體蛋白的水平可以觀察消化道ICC的分布情況及揭示ICC的細胞功能情況。

大鼠生理性衰老過程中的各項指標的觀測結果及變化規律，同樣可以對應到人體在生理性衰老過程中的變化規律。根據本實驗結果，推測在人體生理性衰老過程中，胃腸ICC細胞的c-kit受體表達隨年齡而逐漸下調，導致ICC的數量明顯減少及其作為消化道慢波起搏和介導信號傳導的功能發生障礙，則老年人胃腸的運動功能發生極大的降低。上述變化可能是老年人功能性便秘的發病機制之一。但是由于神經、胃腸激素在消化道運動、分泌和感覺等方面作用的復雜性，對于其具體機制還需要更進一步的研究和探索。

4 參考文獻

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12Ordog T,Ward SM,Sanders KM，etal.Interstitial cells of cajal generate electrical slow wave in the murine stomach〔J〕.J Physiol,1999；518(1):257-69.