腎氣丸對衰老大鼠睪丸抗氧化能力和生精細胞凋亡的影響

吳正平

(宜春學院美容醫學院，江西 宜春 336000)

中醫對人體衰老認識歷史悠久,已經形成了較完整的中醫衰老理論體系,其中腎虛被認為是衰老的根本〔1，2〕。《素問》曰:“丈夫五八,腎氣衰,發墮齒槁；七八腎臟衰,形體皆極”；《醫學正傳》“腎氣盛則壽延,腎氣衰則壽夭”，均明確指出了腎中精氣的虛衰與機體衰老的密切關系。腎氣丸是《金匱要略》中治療腎虛證的經典方，此方陰陽雙補，腎虛得復，元氣充足,從而激發和推動全身各臟腑組織器官的生理功能,延緩衰老。性的變化是人體衰老的重要特征，由于腎氣的不足，男子睪丸、女子卵巢以及其他有關內分泌腺體的衰退是非常明顯的〔1〕。本研究采用D-半乳糖(D-gal)衰老大鼠模型，觀察腎氣丸對衰老大鼠睪酮水平、睪丸組織抗氧化能力和生精細胞凋亡的影響，探討腎氣丸延緩性腺衰老的作用機制。

1 材料與方法

1.1動物與分組 選用清潔級Wistar大鼠40只(南昌大學醫學院動科部提供，合格證號：贛醫動字第02196-02)，體重180～200 g，雄性，隨機分為4組：正常組，亞急性衰老模型組，腎氣丸低、高劑量組。

1.2藥品制備 腎氣丸按8:4:4:3:3:3:1:1的比例取干地黃，山茱萸，山藥，茯苓，澤瀉，牡丹皮，附子，桂枝，煎煮過濾，濾液濃縮成含生藥1.5g/ml溶液。

1.3試劑與儀器 D-gal為北京化學試劑公司產品；睪酮試劑盒由北京北方生物技術研究所提供；SOD、MDA試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。紫外-可見分光光度計(日本島津，型號：UA-240)；酶標儀(美國伯樂，型號：680型)；顯微鏡(日本OLYMPUS，型號：BX53)。

1.4方法

1.4.1造模 除正常組無菌操作頸背部皮下注射生理鹽水外，其他3組頸背部皮下注射D-gal 100 mg·kg-1·d-1，1次/d，連續42 d，造成亞急性衰老大鼠模型。

1.4.2給藥 在造模的同時，腎氣丸低、高劑量給藥組大鼠分別灌胃相應劑量腎氣丸液：5.0、10.0 g·kg-1·d-1，1次/d；正常組、模型組灌以等量生理鹽水。

1.4.3血清睪酮含量測定 各組大鼠于第42天末次給藥2 h后，眼球后靜脈叢毛細管取血，靜置后3 500 r/min離心10 min，取血清備用。嚴格按試劑盒操作程序測定血清睪酮含量。

1.4.4睪丸組織SOD、MDA含量測定 取血后斷頭處死大鼠，取單側部分睪丸組織(約100 mg)，濾紙吸干，迅速冰浴，制成10%的組織勻漿，3 500 r/min離心10 min，取上清備用。嚴格按照試劑盒說明書操作測定SOD、MDA含量。

1.4.5凋亡細胞的檢測 取另一側睪丸,甲醛固定，過夜,常規石蠟包埋、切片,以TUNEL法行凋亡細胞檢測，陽性細胞顯示棕黃色。任取顯微鏡下10個視野,計算含凋亡細胞的陽性曲細精管數；再計算10個陽性曲細精管中的總細胞數和陽性細胞數,計算凋亡細胞的百分比。

2 結 果

2.1一般狀態 對照組大鼠精神狀態好、反應敏捷、毛發光澤順滑。模型組大鼠均出現團居、嗜臥、精神萎靡、行動遲緩、毛色干枯等癥狀，與對照組比較，有顯著差異。腎氣丸組大鼠上述表現與模型組比較有所改善。

2.2大鼠血清睪酮和睪丸組織SOD、MDA含量變化 與正常組比較，模型組大鼠血清睪酮和睪丸組織SOD水平顯著下降(P<0.01)，睪丸組織MDA水平顯著升高(P<0.01)；腎氣丸組與模型組比較，大鼠血清睪酮和睪丸組織SOD水平明顯升高(P<0.05或P<0.01)，睪丸組織MDA水平明顯下降(P<0.05或P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠血清睪酮和睪丸組織SOD、MDA含量變化

2.3大鼠睪丸生精細胞凋亡情況 各組大鼠的睪丸生精細胞均有凋亡現象,模型組大鼠睪丸組織凋亡細胞以成簇形式存在,而正常組和腎氣丸組凋亡細胞單個散在。與正常組比較，模型組大鼠凋亡曲細精管數和凋亡細胞百分率均顯著升高(P<0.01)；腎氣丸組比較模型組，大鼠凋亡曲細精管數和凋亡細胞百分率均明顯降低(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠睪丸生精細胞凋亡情況

3 討 論

組織細胞老化、器官功能下降是隨著年齡增長而逐漸出現的機體衰老現象。大量研究證實性腺功能與機體的衰老程度有著密切關系〔3〕。隨著機體的衰老,睪丸的結構和功能也出現衰退。法國醫學家Brown Sequard的研究顯示睪丸提取液具有延緩衰老的功效,以及性激素替代療法成為諸多老年性疾病的治療方法也給以上觀點提供了理論依據。

睪酮在維持生精功能、促進生殖器官的生長發育方面起著重要作用，其分泌受下丘腦-垂體的調節。衰老時，在下丘腦、垂體功能衰退的影響下,老年男性Leydig細胞功能降低,導致睪酮合成和分泌能力下降,表現為血清睪酮水平降低〔4〕。同時，睪酮水平的降低明顯增加生精細胞的凋亡〔5〕。

衰老的自由基理論1965年由Harman提出〔6〕，已得到現代醫學界的普遍認同。該理論認為，生物體內存在著產生和消除自由基的平衡體系，隨著生物體年齡的增長，體內自由基的產生與消除平衡失調，自由基的產生大于消除，過多的自由基持續地攻擊細胞，使細胞受到損傷，這種損傷積累到一定的程度最終引起機體衰老。因此，衰老是機體內抗氧化酶的活性不斷下降而使自由基逐步積累過剩的結果。SOD是體內主要的抗氧化酶，廣泛存在于機體內的各組織中。SOD能催化超氧陰離子發生歧化反應，使其生成H2O2，H2O2進一步轉變成H2O和O2,從而清除自由基。MDA是動物體內脂質過氧化反應的終產物，其含量能客觀反映機體組織細胞的脂質過氧化程度和自由基的產生情況〔7〕。因此,機體組織SOD、MDA可作為評價動物的衰老進程的敏感指標。

本研究結果表明，腎氣丸可以通過提高衰老大鼠血清睪酮水平、增強睪丸組織抗氧化能力及降低其生精細胞的凋亡指數來提升睪丸功能，起到延緩性腺衰老的作用。

4 參考文獻

1翠 萍.補腎與抗衰老-兼談金匱腎氣丸的抗衰老作用〔J〕.中國實用醫藥，2008；3(17)：144.

2閆潤紅，李 瑞.試論腎虛與衰老〔J〕.山西中醫學院學報，2006；17(5)：8-9.

3Yin YZ,Hawkins KL,Dewolf WC,etal.Heat stress causes testicular germ cell apoptosis in adult mice〔J〕.J Androl,1997；18(2):159.

4Vermeulen A，Kaufman JM.Ageing of the hypothalam opituitary testicular axis in men 〔J〕.Horm Res,1995；4(3):25-30.

5Henriksen K,Hakovirta H,Parvinen M.Testosterone inhibits and induces apoptosis in rat seminiferous tubules in a stage-specific manner:in situ quantification in squash preparations after administration of ethane dimethane sulfonate〔J〕.Endocrinology,1995；136(8):3285.

6Harman D.The free radical theory of aging:Effect of age on serum copper levels〔J〕.J Gerontol，1965；20：151.

7Lantos J,Teme S，Gobolos L,etal.Is peripheral blood a reliable indicator of acuteox idative stress following heart ischemia and reperfusion〔J〕. Med Sci Monit,2001；7(6):1166.