著絲粒蛋白-F在乳腺癌中的表達及其與預后的相關性

聞淑娟 安 欣 楊 航 彭柔君 史艷俠

(中山大學腫瘤防治中心腫瘤內科，廣東 廣州 510060)

乳腺癌的發生是多因素、多階段、進行性發展的過程，涉及多個癌基因的激活和抑癌基因的失活。著絲粒是與細胞周期以及細胞增殖檢查點調控相關的重要結構，組成著絲粒的著絲粒蛋白(CENPs) 是發揮作用的主要元素。CENP-F是人類CENPs中分子量最大的一個成員，在細胞有絲分裂中發揮著重要作用〔1〕。目前國內尚無CENP-F在乳腺癌中的表達及與乳腺癌預后關系的相關研究。本文擬分析CENP-F蛋白在乳腺癌標本中的表達，探討它們與乳腺癌發生發展的關系及預后評估的意義。

1 材料與方法

1.1對象 選取2000年1月至2002年12月在中山大學腫瘤防治中心行乳腺癌改良根治術或根治術的原發性乳腺癌患者158例，全部為女性，術前未行化療、放療和內分泌治療。另選20例正常乳腺組織作為對照組。年齡22～73歲(中位年齡45歲)。所有患者均為浸潤性導管癌(2003年WHO腫瘤分類標準)，ECOG評分≤1；全部乳腺癌病例隨訪73.4 個月(13.3～160個月)。所有患者均有完整的臨床資料。

1.2方法

1.2.1免疫組化方法 按照試劑盒說明書二步法步驟執行 (Dako Carpinteria，CA)。用已知陽性片作為陽性對照，用PBS代替一抗作為空白對照。將石蠟包埋的標本按4 μm切片，常規脫蠟后抗原修復，然后置入3%H2O2室溫孵育15 min后滴加一抗，置于濕盒中4℃過夜；PBS沖洗后滴加辣根過氧化物酶標記的抗兔二抗，室溫孵育30 min；PBS沖洗后DAB顯色，洗滌，蘇木精復染，脫水，透明，中性樹膠封片，鏡下觀察。

1.2.2結果判斷 免疫組化染色結果由兩位病理科醫師獨立閱片得出。CENP-F染色評分采用染色強度及染色程度兩方面評估。出現棕黃色或棕色顆粒的細胞為陽性細胞，CENP-F陽性部位在細胞核。染色強度得分0～3分，0分(無染色)，1分(淡黃色顆粒)，2分(棕黃色顆粒)和3分(棕色顆粒)。染色程度得分0分(0%)，1分(1%～10%)，2分(11%～ 25%)，3分(26%～50%)及4分(>50%)，強度和程度得分之和作為最后CENP-F染色評分(0～7)，最終染色分數<3分為CENP-F陰性表達，≥3分為CENP-F陽性表達。

1.2.3隨訪及評價標準 隨訪從治療第一天開始計算，所有患者均隨訪至2013年6月?？偵鏁r間 (OS)指從診斷之日起至死亡時間。隨訪終止未死亡病例按刪失病例處理。

1.3統計學分析 應用SPSS18.0軟件，各組間率的比較采用χ2檢驗；相關分析采用Spearman等級相關；應用Kaplan-Meier法制作生存曲線，使用Log-Rank檢驗比較生存差異，分析研究OS的線性趨勢。應用Cox比例風險回歸模型行多因素分析。

2 結 果

2.1CENP-F在乳腺癌中的表達 158例乳腺癌組織中，89例陰性表達，69例(43.7%)CENP-F陽性表達，正常乳腺細胞未見CENP-F表達或僅見低表達。見圖1。

圖1 CENP-F在乳腺癌細胞中的過表達(DAB)

2.2CENP-F表達與乳腺癌臨床病理因素的關系 CENP-F 表達與淋巴結轉移(P=0.033)及臨床分期(P=0.027)有關。與年齡、腫塊大小、激素受體(HR)、人表皮生長因子受體(Her-2)及Ki67表達等因素無關(P>0.05)，見表1。

表1 CENP-F的表達與乳腺癌組織臨床病理特點的關系〔n(%)〕

2.3CENP-F陽性表達與患者OS呈負相關 CENP-F陰性表達組患者5年生存率為96.6% (86/89) ，CENP-F陽性表達組患者5年生存率為88.4% (61/69) 。CENP-F陰性組10年總生存率(57.3%)明顯高于陽性組(24.6%)(P<0.001)。 CENP-F的表達與OS有關，CENP-F陰性表達患者的OS明顯高于陽性患者〔(130.00±4.15)vs(103.00±9.09)個月，P=0.004〕(圖2)。應用Cox模型對生存資料行多因素分析，把年齡、腫塊大小、有無淋巴結轉移、TNM分期、CENP-F、HR、HER-2和Ki67表達納入乳腺癌OS的全變量模型分析，結果顯示CENP-F陽性表達(P=0.039)、淋巴結轉移(P=0.045)、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期(P=0.002)、HER-2過表達(P=0.031)及Ki67≥15%(P=0.021)均為影響乳腺癌OS的獨立不良預后因素。而HR的表達則為乳腺癌OS的有利因素(P=0.015)(見表2)。

圖2 CENP-F陽性表達與OS的相關性分析

表2 乳腺癌OS的預后分析

3 討 論

在細胞有絲分裂和減數分裂過程中，著絲粒是保證染色體穩定存在，并且正常分裂、分離到子細胞中的基本結構、功能元件之一。CENP-F 又稱Mitosin/P330d，本質是一種核磷蛋白，全長10.3 kb，編碼3 210個氨基酸，分子量367 kD〔2，3〕。著絲粒位于染色體表面，其上可附著紡錘體微管。CENP-F在有絲分裂中起重要作用，包括著絲粒和著絲點成熟、染色體調整和分離、分裂后期紡錘體的穩定等〔4〕。因此，細胞周期特異性表達的CENP-F可以作為增殖的潛在標記物。目前國外有文獻報道40%左右的乳腺癌患者中有CENP-F的擴增和過表達，CENP-F過表達與腫瘤大小、組織學分級相關，提示該癌基因與乳腺癌進展有關，可能參與細胞的分化調節〔5〕。本實驗結果也提示CENP-F陽性表達與病期進展相關。事實上，CENP-F已被證實在多種腫瘤中均有擴增，且CENP-F的過表達與腫瘤的增殖有密切關系，如非霍奇金淋巴瘤、胃腸間質瘤、鼻咽癌等〔6～8〕。CENP-F能夠促進腫瘤增殖可能與CENP-F的功能有關。CENP-F法尼基化后，在有絲分裂期與其他蛋白參與著絲粒裝配、微管附著、紡錘體檢測〔9〕。CENP-F異常表達使著絲點聚集和紡錘體檢查點功能紊亂，從而促進染色體不正確分離，造成正常遺傳物質丟失，導致遺傳物質的丟失，增加腫瘤的增殖活性〔10〕。

本研究顯示CENP-F陽性表達的乳腺癌患者預后差，生存期短。CENP-F陽性表達是腫瘤不良預后因素的結論在其他腫瘤中也有報道。Cao等〔8〕在鼻咽癌的研究結果顯示，CENP-F過度表達的鼻咽癌腫瘤惡性程度增強，復發和轉移發生早，預后差，并與患者的無病生存和總生存期有關〔7〕。Guardia等〔11〕報道CENP-F高表達的頭頸部鱗狀細胞癌總生存期明顯低于陰性表達組，且CENP-F高表達是頭頸部鱗狀細胞癌OS的不良預后因素之一〔11〕。吳長山等〔12〕研究結果顯示CENP-F陽性表達的腦膜瘤患者具有較高的腫瘤復發率和較短的無瘤生存時間。CENP-F表達與染色體不穩定(CIN)有關，后者在大部分腫瘤分級和預后中起著決定性作用〔13〕，這可能是CENP-F陽性表達是腫瘤不良預后因素的機制。但是，CENP-F的生物學功能與CIN之間的具體機制尚未闡明，今后仍需進一步的深入研究。

綜上所述，CENP-F在乳腺癌中呈擴增和過表達，CENP-F過表達與乳腺癌的發生發展密切相關，CENP-F高表達是乳腺癌的不良預后因素，可作為指導治療和估計預后的參考指標，CENP-F檢測可為臨床確診及預后判斷等提供重要依據。

4 參考文獻

1Coughlin SS，Ekwueme DU.Breast cancer as a global health concern〔J〕.Cancer Epidemiol，2009；33(5)：315-8.

2Skibbens RV，Hieter P.Kinetochores and the check point mechanism that monitors for defects in the chromosome segregation machinery〔J〕.Annu Rev Genet,1998；32：307-37.

3Yerushalmi R，Woods R，Ravdin PM，etal.Ki67 in breast cancer：prognostic and predictive potential〔J〕.Lancet Oncol,2010;11(2)：174-83.

4Varis A，Salmela AL，Kallio MJ.Cenp-F (mitosin) is more than a mitotic marker〔J〕.Chromosoma, 2006;115(4)：288-95.

5O’Brien SL，Fagan A，Fox EJ，etal，CENP-F expression is associated with poor prognosis and chromosomal instability in patients with primary breast cancer〔J〕.Int J Cancer,2007；120(7):1434-43.

6Erlanson M，Casiano CA，Tan EM，etal.Immunohistochemical analysis of the proliferation associated nuclear antigen CENP-F in non-Hodgkin's lymphoma〔J〕.Mod Pathol,1999；12(1)：69-74.

7Koon N，Schneider-Stock R，Sarlomo-Rikala M，etal.Molecular targets for tumour progression in gastrointestinal stromal tumours〔J〕.Gut,2004;53(2)：235-40.

8Cao JY，Liu L，Chen SP，etal.Prognostic significance and therapeutic implications of centromere protein F expression in human nasopharyngeal carcinoma〔J〕.Mol Cancer,2010;9：237.

9Feng J，Huang H，Yen TJ.CENP-F is a novel microtubule-binding protein that is essential for kinetochore attachments and affects the duration of the mitotic checkpoint delay〔J〕.Chromosoma, 2006；115(4)：320-9.

10Fritzler MJ，Rattner JB，Luft LM，etal.Historical perspectives on the discovery and elucidation of autoantibodies to centromere proteins (CENP) and the emerging importance of antibodies to CENP-F〔J〕.Autoimmun Rev,2011；10(4)：194-200.

11de la Guardia C，Casiano CA，Trinidad-Pinedo J，etal.CENP-F gene amplification and overexpression in head and neck squamous cell carcinomas〔J〕.Head Neck, 2001；23(2)：104-12.

12吳長山，肖 瑾，萬經海，等.人腦膠質瘤中CENP-F表達與VEGF及血管增生相關性〔J〕.安徽醫科大學學報,2007;42(6):634-7.

13Kronenwett U，Huwendiek S，Ostring C，etal.Improved grading of breast adenocarcinomas based on genomic instability〔J〕.Cancer Res, 2004;64(3)：904-9.