SiHa細胞中miR-886-5p表達抑制穩定細胞系的建立

王建新 馬翠花

(秦皇島市第一醫院檢驗科， 河北 秦皇島 066000)

宮頸癌已成為女性生命和健康的嚴重威脅〔1～3〕。盡管高致病性人乳頭瘤病毒(HPV)的感染被認為是宮頸癌的主要發病原因，但越來越多的證據表明HPV感染并非宮頸癌發病的單一因素〔4〕。microRNAs(miRNAs)是一類長約21～24個核苷酸的內源性非編碼小分子RNA，抑制很多靶基因的表達〔5〕。miRNAs在調節細胞增殖、凋亡以及腫瘤的發生過程中起重要作用〔6，7〕。很多miRNAs在不同的癌組織中都有異常表達，可能與腫瘤的發生相關〔8～10〕。研究發現在宮頸癌中miRNAs的異常表達與宮頸癌的發生發展密切相關〔11～13〕。基因芯片研究發現miR-886-5p在宮頸癌中的表達明顯高于癌周及正常組織〔14〕。本實驗通過穩定轉染宮頸癌SiHa細胞帶有綠色熒光蛋白(GFP)標簽的miR-886-5p inhibitor/NC，抗生素篩選后選擇表達GFP的陽性克隆進行培養，得到穩定表達抑制miR-886-5p的SiHa細胞系，為深入研究miR-886-5p在宮頸癌SiHa細胞中的作用提供了良好的實驗模型。

1 材料和方法

1.1實驗材料 宮頸癌SiHa細胞購自協和醫科大學基礎醫學研究所。帶有GFP標簽的抑制miR-886-5p表達質粒及對照質粒(miR-886-5p inhibitors/NC)均來自中國吉瑪公司。主要試劑：DMEM 培養基購自GIBCO 公司，三氯甲烷、異丙醇和無水乙醇均購自北京化學試劑公司，TRIzol 試劑，MML-V試劑盒和LipofectamineTM2000 均為美國 Invitrogen公司產品，質粒小量提取試劑盒購自博大泰克公司，SYBR Premix Ex Taq試劑購自TakaRa公司，PCR 擴增引物的合成與 DNA 測序均由上海生工公司完成。

1.2細胞培養與轉染 SiHa細胞培養于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養基內，每3 d換液1次，0.25%胰酶消化傳代，倒置顯微鏡下觀察。在轉染前1 d用12孔板接種細胞，5×105個/孔，培養過夜，待轉染帶有GFP標簽的miR-886-5p inhibitor/NC質粒，每組3個復孔。細胞長滿60%培養孔底時，用不含血清的DMEM各500 μl分別稀釋2 μg待轉染質粒和5 μl LiPofectamine2000轉染試劑，室溫放置5 min后，將兩者混合作用20 min形成DNA-脂質體復合物。分別將1 ml帶有miR-886-5p inhibitor/NC質粒的DNA-脂質體復合物加入各培養孔，輕輕搖勻，37℃、5% CO2、飽和濕度下培養過夜。

1.3轉染細胞的篩選 細胞轉染24 h后，加入5 μg/ml Blasticidin進行篩選，每5 d換液1次，直到長出細胞克隆，在顯微鏡下用胰酶消化，挑出克隆，移至10 cm細胞培養皿繼續用Blasticidin篩選液培養。3～4 w后，熒光倒置顯微鏡下觀察表達GFP的陽性克隆，再次用胰酶消化，挑出陽性克隆并用1 μg/ml Blasticidin篩選液大量培養。

1.4RNA提取及莖環結構的逆轉錄 分別收集培養的轉染不同質粒SiHa細胞(約5×106個)，按產品說明書，加入1 ml TRIzol試劑，吹勻后室溫放置5 min，加入氯仿 0.2 ml，劇烈搖晃15 s，室溫放置3 min，異丙醇沉淀10 min，12 000 r/min 4℃離心10 min，棄上清，加入1 ml 75%乙醇振蕩洗滌后7 500 r/min 4℃離心5 min，吸棄上清，室溫干燥10 min，加入50 μl焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解，55℃放置10 min，紫外分光光度計定量。用1%瓊脂糖凝膠電泳監測RNA質量。莖環逆轉錄miR-886-5p的引物為5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACC-CGCTT-3′；以hs-U6作為內參，引物序列為5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。

1.5實時定量PCR 取總RNA(1～2 μg)，用SYBR Premix Ex Taq Mix 10 μl，上下游引物各1 μl，蒸餾水補足20 μl體積。以hs-U6作為內參，進行實時定量PCR反應檢測miRNA的表達，反應包括40個循環(95℃，30 s；60℃，1 min)，每次設立3個復孔。特異性miR-886-5p的上下游引物分別為5′-CGGGTCGGAGTTAGCTCA-3′和5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6 snRNA的上下游引物分別為5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′和 5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。其擴增曲線和融解曲線說明引物具有很好的特異性，將擴增產物進行DNA測序分析進一步證實擴增特異性。采用ΔΔCt法分析基因的表達水平〔15〕，即RQ=2-ΔΔCt，〔ΔΔCt=(CtmiRNA-CtU6)樣品(CtmiRNA-CtU6)校正樣品〕。每次實驗包括以水為模板的陰性對照，根據(2-ΔΔCT)計算每對樣本的相對表達量。

(A)SiHa細胞系穩轉GFP標記的miR-886-5p表達抑制及對照質粒篩選4 w后熒光鏡圖片；(B) SiHa細胞系穩轉miR-886-5p表達抑制及對照質粒后miR-886-5p表達量的qRT-PCR驗證，U6snRNA為內參，1)P <0.05

2 結 果

用帶有GFP標簽的miR-886-5p inhibitor及對照質粒轉染SiHa細胞，Blasticidin篩選3～4 w后于熒光倒置顯微鏡下觀察表達GFP的陽性克隆(圖1)。挑取陽性克隆大量培養后用qRT-PCR驗證穩轉細胞中miR-886-5p的表達差異，每組3個復孔，實驗重復3次，差異顯著(P<0.05)。見圖1。

3 討 論

眾所周知，高危型HPV感染是宮頸癌發病的主要原因，其分子機制也成為人們研究的焦點。然而HPV感染并不能為宮頸癌的惡變過程提供足夠的證據，目前其他因素對宮頸癌的影響也受到了關注〔14〕。

研究報道顯示不同miRNAs的異常表達在不同的癌癥中起著不同的作用〔16～18〕。miRNAs表達分析顯示miR-143和miR-145在宮頸癌組織及宮頸癌相關細胞系中表達下調，它們起著抑制宮頸癌相關細胞的生長作用；而miR-146a在宮頸癌組織及宮頸癌相關細胞系中表達上調，能促進宮頸癌相關細胞的增殖〔12〕。

目前關于miRNAs與宮頸癌細胞的凋亡之間的關系研究很少，有研究發現miR-886-5p在宮頸癌的含量明顯高于癌周及癌旁組織。

4 參考文獻

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