斜鏈擬青霉菌絲體粗提物體內(nèi)外抗氧化作用

楊 成 陳名君 董 群

(皖南醫(yī)學院微生物學與免疫學教研室，安徽 蕪湖 241002)

自由基清除劑可直接或間接清除體內(nèi)過多的自由基，有效阻止或防止由于過多自由基而導(dǎo)致的氧化損傷，起到保護機體延緩衰老的作用〔1〕。因此，開放與研究抗氧化劑具有重要的意義。而有關(guān)蟲生真菌抗氧化活性的報道多集中在體外實驗研究〔2～5〕，本實驗采用體外與體內(nèi)相結(jié)合的方法對其擬青霉屬中的斜鏈擬青霉菌絲體粗提物進行抗氧化實驗。

1 材料與方法

1.1試劑、藥品、菌株 斜鏈擬青霉由安徽農(nóng)業(yè)大學微生物防治省重點實驗室提供。蛋白胨10 g/L，葡萄糖40 g/L，酵母浸出粉10 g/L，蒸餾水1 000 ml。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·)(購自Sigma公司)，D-半乳糖(購自博美生物公司)，考馬斯亮藍(購自博美生物公司)，超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MDA)試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)，其他均為國產(chǎn)分析純。

1.2實驗動物 昆明系小鼠18～22 g，雌雄各半，由南京醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(蘇)2007-0001。

1.3方法

1.3.1斜鏈擬青霉菌絲體粗提物制備 采用上述SDAY液體培養(yǎng)基，以10%的接種量接入一級液體種子，置28 ℃ 真菌培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)25 d后洗滌抽濾，取洗滌后菌絲體65℃烘箱中烘干稱重，以甲醇為提取溶劑，按質(zhì)量與提取劑體積之比1∶30(w/v)，超聲波提取4 h后離心收集上清，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀45℃真空濃縮至干備用。

1.3.2斜鏈擬青霉菌絲體粗提物體外抗氧化實驗 參照文獻〔4，5〕方法，甲醇溶解樣品制成不同濃度1、2、4、8、16 mg/ml，取各濃度樣品100 μl和預(yù)先用95%乙醇配制的0.4 mg/ml的DPPH自由基100 μl于96孔酶標板中，每個樣品重復(fù)3次。將加完后將酶標板置酶標儀中振動30 s，37℃波長517 nm測定其吸光值(Ap)，37℃保溫10 min再測定1次，同時測定不加DPPH自由基的樣品空白吸光值(Ac)和加DPPH自由基以甲醇代替樣品的吸光值(Amax)。計算相對自由基清除率。

1.3.3體內(nèi)抗氧化實驗動物分組與處理 參照文獻〔6～8〕方法，取昆明系小鼠35只，隨機分為5組，設(shè)正常組，模型組，藥物高、中、低劑量組，除正常組皮下注射生理鹽水外，其余4組125 mg·kg-1·d-1皮下注射D-半乳糖造模，同時對藥物組進行灌胃給藥治療，高、中、低劑量組給予900、300、100 mg/kg，正常組和模型組給予等量蒸餾水，連續(xù)6 w。按常規(guī)眼球取血，加肝素抗凝后2 500 r/min 離心 10 min，取上清冷藏備用；斷頸處死，取出肝組織用冰生理鹽水洗滌去除血液，濾紙吸干，按肝組織重量/冰生理鹽水量比為1∶10的量制備肝組織勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清冷藏備用。

1.3.4小鼠血漿中SOD活力與肝組織中MDA含量的測定 取上述1.4中獲得的血漿和肝組織勻漿，分別按SOD活力試劑盒和MDA試劑盒測定其含量，操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行，根據(jù)標準曲線計算含量。

1.5統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0軟件進行F檢驗。

2 結(jié) 果

2.1斜鏈擬青霉菌絲體粗提物體外對DPPH自由基的清除活性 斜鏈擬青霉菌絲體粗提物具有清除DPPH自由基活性，且不同時間和各濃度對DPPH自由基的清除能力不同，清除活性隨樣品濃度的遞大而增強，終反應(yīng)10 min時樣品對0.4 mg/ml的DPPH自由基相對清除率IC50為1.81 mg/ml。見表1。

表1 粗提物對DPPH自由基的相對清除率(%)

2.2斜鏈擬青霉菌絲體粗提物對小鼠血漿SOD活性和肝組織中MDA含量的影響 表2可見，對與SOD活性，高劑量組、中劑量組與模型組比較，粗提物能明顯提高小鼠血清中SOD活性(P<0.05)。但給藥組與正常組比較差異不顯著(P>0.05)；對于MDA含量，模型組與正常組相比差異明顯(P<0.05)，高劑量組與正常組、模型組比較差異顯著(P<0.01)，而中劑量組、低劑量組與模型組比較，能明顯的降低MDA(P<0.01)，增強機體對抗氧化損傷的能力。

表2 粗提物對衰老小鼠SOD活性和MDA含量的影響±s，n=7)

3 討 論

衰老的自由基學說認為自由基攻擊生物膜中不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化作用，從而破壞細胞完整的膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細胞死亡。實驗采用DPPH抗氧化活性體外評價體系對斜鏈擬青霉菌絲體粗提物體外清除自由基活性進行評價，同時利用給小鼠連續(xù)皮下注射大劑量D-半乳糖，造成其糖代謝紊亂，進而被半乳糖氧化酶氧化產(chǎn)生超氧陰離子等氧自由基，攻擊膜磷脂中的不飽和脂肪酸。而MDA就是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物，也使細胞膜蛋白發(fā)生交聯(lián)，進一步加劇細胞結(jié)構(gòu)損害。除此之外，自由基還可以攻擊細胞中DNA和其他生物大分子而導(dǎo)致其損傷，引起機體衰老、癌癥等疾病。另一方面，機體內(nèi)的SOD具有清除自由基作用，提高機體抗氧化酶活性，可以抑制或清除機體內(nèi)過多的自由基，維持機體內(nèi)氧化與抗氧化之間的平衡起，因此，檢測這兩項指標可以從一個側(cè)面反映了藥物在體內(nèi)的抗氧化效果〔9〕。由實驗結(jié)果可知，斜鏈擬青霉菌絲體粗提物在體外對DPPH自由基具有很強的清除作用；在體內(nèi)，對于D-半乳糖所致的小鼠亞急性衰老模型，斜鏈擬青霉菌絲體粗提物既能提高其血漿中SOD活性，又降低肝組織中MDA含量，因而，顯示出較好的抗氧化活性。

4 參考文獻

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