頭孢曲松鈉對(duì)糖尿病急性腦缺血再灌注大鼠細(xì)胞凋亡及缺氧誘導(dǎo)因子表達(dá)的影響

熊建忠 顏志婷 林小小 黃樂(lè)松

(萍鄉(xiāng)市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江西 萍鄉(xiāng) 337055)

腦缺血是臨床上常見(jiàn)的心腦血管疾病，與糖尿病(DM)、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、腦卒中等因素有密切的關(guān)系〔1〕。盡快改善心腦組織血液供應(yīng)是治療腦缺血的重點(diǎn)，然而患者血流灌注得到恢復(fù)后可能會(huì)出現(xiàn)缺血再灌注，會(huì)給患者的腦組織再次造成損傷。缺血再灌注出現(xiàn)的原因復(fù)雜，臨床研究發(fā)現(xiàn)其與細(xì)胞凋亡、炎癥等因素有關(guān)，不僅會(huì)影響患者的預(yù)后，同時(shí)對(duì)患者的生命安全造成極大的威脅。因此，選擇有效的方法改善緩解再灌注損傷、保護(hù)神經(jīng)是臨床研究的重點(diǎn)。本研究觀察頭孢曲松鈉對(duì)DM急性腦缺血再灌注大鼠細(xì)胞凋亡及缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)表達(dá)的影響。

1 資料與方法

1．1一般資料 選擇100只健康的雄性SD大鼠，體重225～276 g，平均(242±11)g。隨機(jī)分成對(duì)照組和觀察組各50只。其中頭孢曲松鈉由山東羅欣藥業(yè)股份有限公司提供，鏈脲佐菌素來(lái)自于上海信然生物科技有限公司，DNA末端轉(zhuǎn)移酶缺口末端標(biāo)注法(TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京啟維益成科技有限公司，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)熒光顯色與試劑盒均由上海研域生物科技有限公司生產(chǎn)提供，上海精密儀器公司提供的型號(hào)為XSP-3C的單目生物顯微鏡，鼠抗兔HIF-1A多克隆抗、二抗由北京艾然生物科技有限公司生產(chǎn)提供。

1．2方法

1.2.1研究模型的建立 主要通過(guò)腹腔內(nèi)注射鏈尿佐菌素、動(dòng)脈線栓與再灌注的方法建立DM急性腦缺血再灌注大鼠的研究模型〔2〕。注射鏈尿佐菌素前，100只健康的雄性SD大鼠先禁食6 h，然后腹腔內(nèi)注射1%鏈尿佐菌素溶液，當(dāng)大鼠的血糖水平超過(guò)11.1 mmol/L時(shí)表明DM大鼠的研究模型建立成功。對(duì)DM大鼠腹腔鏡注射水合氯醛起麻醉效果，切口選擇于頸正中部位，游離并結(jié)扎頸動(dòng)脈，然后在頸總動(dòng)脈分叉處作1個(gè)小切口，把尼龍線(已預(yù)熱成圓頭)置放于頸內(nèi)動(dòng)脈，待出現(xiàn)阻力后固定尼龍線并關(guān)閉切口，至大鼠缺血2 h后拉動(dòng)尼龍線實(shí)現(xiàn)再灌注。

1.2.2干預(yù)方法 觀察組大鼠于腹腔內(nèi)注射頭孢曲松鈉，藥物劑量控制為200 mg/kg，對(duì)照組大鼠腹腔內(nèi)注射生理鹽水，劑量與觀察組相同，第1次給藥選擇在術(shù)后6 h，1次/d，連續(xù)5 d。

1．3觀察指標(biāo) ①皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞凋亡。通過(guò)TUNEL法對(duì)皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行觀察，嚴(yán)格按照試劑盒的操作步驟展開(kāi)檢測(cè)。②腦組織的含水量。取下干預(yù)治療后的大鼠大腦皮質(zhì)組織與皮質(zhì)下組織，稱取毛重，烘干后稱取凈重，含水量=(毛重-凈重)/毛重×100%。③HIF〔3〕。通過(guò)免疫組化法進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定免疫組化染色的平均光密度值(MOD)來(lái)觀察缺氧誘導(dǎo)因子表達(dá)的高度。

1．4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞凋亡 大鼠腦皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞凋亡數(shù)量隨著腦缺血再灌注時(shí)間的增加而不斷增加，至12～24 h達(dá)到最高值，然后逐漸下降。觀察組大鼠在各個(gè)時(shí)段腦皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞凋亡數(shù)量均少于對(duì)照組(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 兩組大鼠經(jīng)干預(yù)治療后各時(shí)段皮質(zhì)區(qū)細(xì)胞凋亡的比較±s，個(gè)/高倍視野,n=50)

2.2腦組織的含水量 干預(yù)前，兩組大鼠腦組織的含水量比較差異不顯著(P>0.05)。經(jīng)干預(yù)治療后，觀察組大鼠在各個(gè)時(shí)段腦組織的含水量均少于對(duì)照組(均P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 兩組大鼠經(jīng)干預(yù)各時(shí)段腦組織含水量的比較±s，%,n=50)

2.3HIF表達(dá) 大鼠腦皮質(zhì)區(qū)HIF的表達(dá)隨著腦缺血再灌注時(shí)間的增加而增強(qiáng)，至12～24 h達(dá)到最高值，隨后逐漸減弱。觀察組大鼠在干預(yù)后各個(gè)時(shí)段的腦皮質(zhì)區(qū)HIF MOD值低于對(duì)照組HIF(P<0.01)。見(jiàn)表3。

表3 兩組大鼠干預(yù)各時(shí)段的腦皮質(zhì)區(qū)HIF平均光密度值的比較±s，個(gè)/高倍視野,n=50)

3 討 論

動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)〔4〕發(fā)現(xiàn)在血糖高的同時(shí)并發(fā)腦梗死，會(huì)很大程度增加梗死范圍，這可能與腦細(xì)胞酸中毒有密切的聯(lián)系，血糖升高嚴(yán)重影響梗死的預(yù)后。血糖升高會(huì)促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生〔5〕，進(jìn)一步增強(qiáng)了氧自由基對(duì)腦細(xì)胞的損傷作用，并且血糖升高可能會(huì)加劇炎癥反應(yīng)而加重對(duì)腦細(xì)胞的損傷〔6〕。林冬融等〔7〕觀察了高血糖加重腦缺血再灌注損傷的作用，認(rèn)為相同再灌注時(shí)間點(diǎn)高血糖組神經(jīng)功能缺損比正常血糖組嚴(yán)重，而且相同再灌注時(shí)間點(diǎn)高血糖組凋亡細(xì)胞數(shù)目及細(xì)胞色素C表達(dá)也明顯高于正常血糖組。研究還顯示低灌注期間腦組織的損傷可能與自由基代謝異常有關(guān)〔8〕，過(guò)量的自由基會(huì)引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，會(huì)直接導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡，并且能以轉(zhuǎn)錄因子、介導(dǎo)線粒體等形式引起細(xì)胞的凋亡。機(jī)體處于缺血的狀態(tài)，尤其是再灌注期間，機(jī)體無(wú)法有效清除自由基，導(dǎo)致脂質(zhì)、核酸以及蛋白質(zhì)過(guò)氧化，加劇氧化應(yīng)激反應(yīng)〔9〕。HIF屬于核蛋白〔10〕，通常在組織處于缺血缺氧的狀態(tài)下形成，HIF可以和靶基因結(jié)合，從而造成機(jī)體對(duì)缺血缺氧形成耐受性。HIF十分不穩(wěn)定，檢測(cè)難度較大，然而在缺血缺氧時(shí)其降解被抑制，HIF表達(dá)增強(qiáng)。

頭孢曲松鈉屬于抗生素藥物〔11〕，然而諸多研究發(fā)現(xiàn)其在緩解腦缺血損傷以及再灌注損傷、保護(hù)神經(jīng)等方面發(fā)揮出積極顯著的作用〔12,13〕。頭孢曲松鈉能有效清除自由基，從而減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)腦細(xì)胞組織產(chǎn)生的損傷，同時(shí)頭孢曲松鈉可以促進(jìn)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(GLT)-1 mRNA表達(dá)，加強(qiáng)GLT-1 表達(dá)與提高其轉(zhuǎn)運(yùn)功能，進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)的效果〔14〕。同時(shí)頭孢曲松鈉能顯著改善腦水腫，緩解腦組織細(xì)胞缺氧，有效抑制HIF表達(dá)〔15〕。本次研究結(jié)果顯示頭孢曲松鈉在糖尿病急性腦缺血再灌注治療中的價(jià)值。

綜上，頭孢曲松鈉在DM急性腦缺血再灌注的治療中具有較高的應(yīng)用價(jià)值，能顯著降低細(xì)胞凋亡數(shù)量、改善腦水腫癥狀以及抑制HIF表達(dá)，從而起到保護(hù)神經(jīng)的效果。

4 參考文獻(xiàn)

1張鮮紅.腦出血繼續(xù)出血危險(xiǎn)因素探討〔J〕.中國(guó)醫(yī)師雜志，2012;2(z2)：60-1.

2范瑞娟，羅亞非，孫玉鳳.新式線栓法建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型的建立〔J〕.中國(guó)民族民間醫(yī)藥，2014;23(2)：26-7.

3唐寶蒼，馬建國(guó)，畢向鋒.依達(dá)拉奉對(duì)糖尿病腦缺血再灌注大鼠細(xì)胞凋亡及缺氧誘導(dǎo)因子表達(dá)的影響〔J〕.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2010;27(6)：521-3.

4張亞敏，徐 虹，孫 華，等.線栓法制作大鼠局灶性腦缺血再灌注模型的研究及體會(huì)〔J〕.醫(yī)學(xué)研究雜志，2014;43(1)：27-30.

5景 麗，張建忠，馬 軼，等.高血糖加重全腦缺血再灌注后缺血不敏感區(qū)神經(jīng)元損傷〔J〕.解剖學(xué)雜志，2011;34(4)：496-9.

6邢變枝，陳 暉，王 磊，等.缺血后處理對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后環(huán)氧合酶-2的影響〔J〕.職業(yè)與健康，2013;29(18)：2291-3.

7林冬融，韓江全，胡泳濤.高血糖對(duì)大鼠腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞色素C表達(dá)的影響〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2013;33(16)：3878-80.

8Batra A，Latour LL，Ruetzler CA，etal． Increased plasma and tissue MMP levels are associated with BCSFB and BBB disruption evident on post-contrast FLAIR after experimental stroke〔J〕． J Cereb Blood Flow Metab，2010;30(6)：1188-99．

9黃 惠，王 嶺，李 艷，等.黃芪注射液對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用研究〔J〕.卒中與神經(jīng)疾病，2014;21(1)：19-22.

10Singh N， Sharma G， Mishra V.Hypoxia inducible factor-1： its potential role in cerebral ischemia〔J〕.Cell Mol Neurobiol,2012;32(4)：491-507.

11Alta M， Meydan S， Aras M，etal.Effects of ceftriaxone on ischemia/reperfusion injury in rat brain〔J〕.J Clin Neurosci,2013;20(3)：457-61.

12劉春華，王維治.頭孢曲松鈉對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦損傷和谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體-1表達(dá)的影響〔J〕.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2011;28(7)：583-5.

13Th?ne-Reineke C， Neumann C， Namsolleck P，etal.The beta-lactam antibiotic， ceftriaxone， dramatically improves survival， increases glutamate uptake and induces neurotrophins in stroke〔J〕.J Hypertens,2008;26(12)：2426-35.

14Li F， Huang L， Su XL，etal.Inhibition of nuclear factor-κB activity enhanced chemosensitivity to cisplatin in human lung adeno-carcinoma A549 cells under chemical hypoxia conditions〔J〕.Chin Med J (Engl),2013;126(17)：3276-82.

15Osumi T,Awazu T,Fujimura E，etal.Leukemia kidney infiltration can cause secondary polycythemia by activating hypoxia-inducible factor (HIF) pathway〔J〕.Eur J Pediatr，2013;172(6)：829-32.