消旋卡多曲對(duì)老年大鼠腦內(nèi)淀粉樣蛋白水平的影響

張健昌 黃家園 黃 河 周嘉雯 暴 瓏 謝 敏 朱 銘 張艷翎 黎 黎 吳科鋒 李文德 黃 韌

(廣東醫(yī)學(xué)院第一臨床學(xué)院，廣東 湛江 524023)

消旋卡多曲可用于成人、老人及兒童急性腹瀉的治療〔1～3〕，其在體內(nèi)迅速代謝為活性物質(zhì)硫芬(TP),TP通過(guò)抑制腦啡肽酶(NEP)活性，保護(hù)內(nèi)源性腦啡肽免受機(jī)體降解，延長(zhǎng)消化道內(nèi)源性腦啡肽的生理活性，進(jìn)而抑制水和電解質(zhì)的過(guò)度分泌來(lái)發(fā)揮其抗腹瀉作用〔4〕。TP可導(dǎo)致NEP活性降低，引起皮質(zhì)和腦脊液中的β-淀粉樣蛋白(Aβ)增多〔5～7〕，甚至可在海馬及其他大腦區(qū)域出現(xiàn)β-淀粉樣斑塊的沉積〔8～11〕。現(xiàn)有理論認(rèn)為Aβ是導(dǎo)致阿爾茨海默病(AD)發(fā)病的始動(dòng)因素，Aβ更是AD的主要病理特征〔12〕。本研究探討消旋卡多曲對(duì)老年SD大鼠淀粉樣蛋白水平的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑 SPF級(jí)SD大鼠30只，雌雄各半，10月齡(由廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：2009A034)，體重250 g±35 g。消旋卡多曲(山東鉑源化學(xué)有限公司)；鼠原性Aβ1～40、Aβ1～42、NEP ELISA試劑盒(美國(guó)RD公司)；Jk-6生物組織攤烤片機(jī)，JB-P5生物組織包埋機(jī)，生物組織脫水機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)；轉(zhuǎn)輪切片機(jī)(德國(guó)萊卡有限公司)；尼康生物顯微鏡(日本尼康股份有限公司)。其余試劑均為分析純。

1.2消旋卡多曲供試液制備 消旋卡多曲100 g，置燒杯中，適量聚乙二醇400(PEG400)溶解，加蒸餾水配成含20% PEG 400的消旋卡多曲混懸液，標(biāo)示量為100 mg/ml母液，置4℃冰箱備用。

1.3實(shí)驗(yàn)分組和處理 30只SD大鼠，隨機(jī)分為空白對(duì)照組、消旋卡多曲高劑量組(50 mg/kg)、消旋卡多曲低劑量組(100 mg/kg)每組10只。消旋卡多曲各劑量組，1次/d，灌胃給予相應(yīng)量的消旋卡多曲混懸液。空白對(duì)照組，1次/d，灌胃給予等量的20% PEG400溶液。28 d后，采血，置抗凝管，3 000 r/min，離心10 min，分離血漿。處死大鼠，快速取腦組織，左半球中性甲醛固定，右半球-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4ELISA法測(cè)定大腦及外周血中NEP及Aβ水平 取分離好的血漿及腦組織，按試劑盒說(shuō)明書(shū)，加入相應(yīng)量的標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)品各50 μl于反應(yīng)孔，并加入50 μl的生物素標(biāo)記的抗體。依次每孔加入60 μl的親和鏈霉素-HRP，底物A、B各50 μl。酶標(biāo)儀波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定各孔OD值。

1.5病理觀察海馬神經(jīng)元病理改變 取目標(biāo)組織修塊,置于包埋塑料盒,自來(lái)水沖洗24 h，后脫水、透明、浸蠟、包埋、修塊、切片，進(jìn)行HE染色，置于40倍光鏡下觀察神經(jīng)元數(shù)目的改變、萎縮的情況，選相同的病變部位(海馬區(qū)CA3及齒狀回)連續(xù)照相。

2 結(jié) 果

2.1消旋卡多曲對(duì)血漿中Aβ1～40、Aβ1～42、NEP含量的影響 外周血中，消旋卡多曲各劑量組與空白對(duì)照組相比，Aβ1～40和Aβ1～42含量盡管稍有增加，但差異無(wú)顯著性(P>0.05)；亦無(wú)明顯降低NEP含量的跡象(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 消旋卡多曲對(duì)大鼠血漿中Aβ1～40、Aβ1～42、NEP含量的影響(n=10，OD，±s)

2.2消旋卡多曲對(duì)腦組織中Aβ1～40、Aβ1～42、NEP含量的影響 與空白對(duì)照組相比，消旋卡多曲各劑量組均能明顯增加腦組織中Aβ1～40及Aβ1～42含量(P<0.05)，但組間差異不明顯，也有降低腦內(nèi)NEP含量的跡象，但僅高劑量組差異顯著(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 消旋卡多曲對(duì)大鼠腦組織中Aβ1～40、Aβ1～42、NEP含量的影響(n=10，OD，±s)

2.3消旋卡多曲對(duì)大鼠腦中海馬組織的CA3區(qū)和齒狀回區(qū)的損傷情況 圖1可見(jiàn)，大鼠海馬CA3區(qū)，消旋卡多曲各組較空白對(duì)照組，鏡下可見(jiàn)明顯的神經(jīng)細(xì)胞胞體固縮，胞核深染，核仁不明顯，且高劑量組有明顯的神經(jīng)元萎縮。在海馬齒狀回區(qū)域可發(fā)現(xiàn)消旋卡多曲各組均出現(xiàn)局部顆粒細(xì)胞深染，核仁核膜分界不清的情況，神經(jīng)元細(xì)胞萎縮明顯，且高劑量組有明顯可見(jiàn)的神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量減少(見(jiàn)圖2)。

3 討 論

消旋卡多曲有研究〔13〕指出往人體內(nèi)靜脈輸注156 μg Acetorphan(與Racecadotril屬同一藥物)〔14〕后，顯示腦脊液內(nèi)的NEP活性下降大約65%。NEP在中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有重要的生理功能，尤其在清除腦內(nèi)Aβ過(guò)程中起著重要作用，是Aβ降解的主要限速酶〔8，11〕，表明腦啡肽酶活性即使是部分降低也可以使Aβ升高乃至沉積，最終導(dǎo)致AD的發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)這說(shuō)明消旋卡多曲引起了實(shí)驗(yàn)對(duì)象大腦內(nèi)Aβ水平升高，與相關(guān)研究小組在其他實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和本課題組在恒河猴腦內(nèi)直接注入Thiophan能夠引起皮層及基底核的神經(jīng)元內(nèi)淀粉樣蛋白增多以及海馬等部位神經(jīng)元損傷的結(jié)果相一致〔15，16〕。此外，病理檢查提示超量應(yīng)用消旋卡多曲可促使大腦Aβ表達(dá)水平增高，對(duì)神經(jīng)元造成損傷，海馬區(qū)尤甚，有增加AD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的可能。

文獻(xiàn)〔17，18〕調(diào)研發(fā)現(xiàn)，歐洲3～89歲的腹瀉患者口服消旋卡多曲發(fā)生的不良反應(yīng)以消化系統(tǒng)疾病為主，占68.82%，主要表現(xiàn)為便秘、嘔吐、腹脹、肝損害等，其中便秘發(fā)生率最高，神經(jīng)系統(tǒng)的不良反應(yīng)僅占10.22%，表現(xiàn)僅為頭暈、頭痛等癥狀，未見(jiàn)其他嚴(yán)重不良反應(yīng)，但絕大部分動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示靜注或直接腦內(nèi)給藥，均導(dǎo)致β樣淀粉蛋白沉積及發(fā)生不同程度的神經(jīng)元細(xì)胞萎縮。消旋卡多曲在國(guó)內(nèi)僅批準(zhǔn)為用于兒童急性腹瀉，對(duì)于成人尤其是老年人的使用并無(wú)明令禁止。盡管尚無(wú)相關(guān)臨床資料指出消旋卡多曲能明顯增加AD發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，但結(jié)合本實(shí)驗(yàn)及過(guò)往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果，該藥在老年人(尤其是AD患者)仍應(yīng)慎用，應(yīng)注意控制用藥劑量及時(shí)間。

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