滇白珠水提物對慢性阻塞性肺疾病大鼠轉化生長因子-β1、白細胞介素-8的影響

王小莉 呂江明

(吉首大學醫學院，湖南 吉首 416000)

慢性氣道炎癥和以氣道壁成纖維細胞增生及細胞外基質沉積為特點的氣道構型的重建是慢性阻塞性肺疾病(COPD)肺組織的重要病理特征,但氣道炎癥尤其是氣道重建的分子機制尚未闡明。滇白珠具有祛風除濕、活血化疲、通絡止痛、清熱解毒等功效，用于風濕性關節炎、慢性氣管炎、風寒感冒等證〔1〕。長期以來，滇白珠治療COPD停留在民間藥用水平上，缺乏深入的實驗研究，本研究旨在通過檢測轉化生長因子(TGF)-β1、細胞因子白細胞介素(IL)-8的變化，探討滇白珠治療COPD的機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組 健康SD雄性大鼠36只(長沙市開福區東創實驗動物科技服務部購買，動物編號HNACSDC20120292)，鼠齡12 w，體重(274±29)g。隨機分為正常對照組、模型組和用藥組各12只。

1.2COPD模型制備方法 將模型組的大鼠放入有機玻璃制成的煙熏箱內，在其右上角開通一個直徑1 cm的通氣孔。大鼠吸煙2次/d；16支/次，時間30 min，2次間隔4 h，連續75 d。被動吸煙方法：將點燃的香煙(購買的長沙卷煙廠生產的白沙牌香煙)通過三通將煙霧吸入100 ml的注射器中，關閉吸煙通路一端，再打開三通的另一端將煙霧注入煙熏箱內進行大鼠被動吸煙。用藥組：吸煙8 d后每天吸煙染毒前通過胃管給大鼠灌胃滇白珠水提物(2 ml/次，原藥1 ml/次，加生理鹽水2 ml)共75 d。正常對照組氣管內滴入等量的生理鹽水，25 d后處死大鼠用于實驗觀察。

1.3滇白珠水提物的提取 滇白珠由我院呂江明老師在湘西鳳凰臘兒山采集，由我院中藥學李春艷教授鑒定。將滇白珠根莖葉藥材450 g干燥、粉碎，過20目篩，水煮3次，30 min/次，合并水煎液，濃縮為1 g/ml，得到滇白珠水提物。

1.4支氣管肺泡灌洗液(BALF)的采集 將大鼠用2%的戊巴比妥(25 mg/kg)麻醉后仰臥固定于操作臺，切開胸部，暴露出氣管和雙肺，結扎右主支氣管，在隆突上用套管針穿刺至左肺，緩慢注入無菌生理鹽水3 ml，每次注入后立即回吸得到BALF，重復3次。灌洗液紗布過濾，回收率為60%～70%。

1.5病理標本的制作 實驗各組于吸煙染毒結束后次日取每只大鼠右中葉肺組織，肺組織標本經 4%多聚甲醛灌注內固定后，取材放入4%中性甲醛固定24 h，石蠟包埋切片，進行HE染色及免疫組織化學染色，免疫組織化學染色參照試劑盒推薦的SP法進行操作。每組切片任選1張用PBS液代替一抗進行染色,為陰性對照。TGF-β1多克隆抗體1∶50稀釋,陽性表達為細胞胞質呈棕黃色顆粒狀改變。

1.6TGF-β1、IL-8的檢測 應用TGF-β1檢測試劑盒以ELISA對支氣管肺泡灌洗液和血清進行TGF-β1、IL-8的活性檢測(武漢博士德公司生產試劑盒)。

2 結 果

2.1病理改變 模型組的大鼠大體觀察可見肺體積較正常對照組明顯增大，顏色蒼白，彈性減弱，有多少不等的肺泡融合形成大皰。光鏡下觀察，可見肺泡管、肺泡囊和肺泡明顯擴張，肺泡壁變薄，并有不同程度的斷裂。用藥組大鼠的支氣管黏膜上皮脫落較模型組明顯減輕,炎性細胞浸潤以及肺泡壁斷裂和肺泡腔擴大情況亦較模型組減輕，較正常對照組重。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織病理學(HE，×100)

2.2肺組織TGF-β1的免疫組化結果 模型組(0.732±0.083)與正常對照組(0.168±0.018)大鼠比較顯著增加(P<0.05)。用藥組(0.538±0.059)與模型組與比較顯著減少(P<0.05)。

2.3支氣管肺泡灌洗液中TGF-β1、IL-8的活性測定 模型組與正常對照組比較,用藥組與模型組比較均有顯著差異(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠支氣管肺泡灌洗液中TGF-β1、

2.4血清中TGF-β1、IL-8的活性測定 模型組與正常對照組比較,用藥組與模型組比較均有顯著差異(P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠血清中TGF-β1、IL-8活性比較±s，n=12)

3 討 論

COPD是一種不能完全可逆的氣流受限為特征的疾病，氣流受限進行性發展，多與肺部對有害顆粒與氣體的異常炎癥反應有關〔2〕。

TGF-β1是一種具有多種功能的生長因子,主要表達于支氣管、肺泡上皮細胞及肺泡巨噬細胞，廣泛參與氣道炎癥反應與氣道重建，是COPD炎癥損傷修復的重要因子。韓玲等〔3〕研究發現，慢性支氣管炎組、COPD組TGF-β1的表達明顯高于對照組，提示TGF-β1在COPD發病早期即可增高,由于組織重建及纖維化改變，TGF-β1增高早于肺功能異常而出現。本研究顯示，被動吸煙模型組大鼠支氣管肺泡灌洗液和血清中的TGF-β1表達均明顯增加，支氣管、肺組織中的表達顯著增強，提示TGF-β1參與了COPD的炎癥發生和發展。同時研究還發現應用滇白珠水提物后，用藥組大鼠TGF-β1的表達明顯下降，此結果提示，通過對TGF-β1的抑制，使炎癥細胞的聚集、趨化減輕可能是滇白珠水提物干預COPD氣道炎癥反應的機制之一，可以認為滇白珠可通過調控TGF-β1,從而減輕實驗性慢阻肺大鼠氣道炎癥和慢性損傷。

IL-8是一種多細胞源性的細胞因子。它是脂多糖、IL-1和腫瘤壞死因子(TNF)刺激時主要由單核和(或)巨噬細胞分泌的,也是中性粒細胞、T淋巴細胞的一種趨化因子,在炎癥和免疫過程中具有重要調節意義〔4，5〕。在COPD發病過程中，IL-8在中性粒細胞所致炎癥中起了相當重要的作用，IL-8水平與氣流阻塞程度、氣道的炎癥相匹配。本實驗說明滇白珠水提物能降低COPD大鼠血清及肺泡灌洗液中IL-8的表達，減少炎性細胞因子的釋放，從而控制氣道炎癥。

總之，COPD的發病機制是非常復雜的，TGF-β1、IL-8參與了COPD的發病過程，滇白珠水提物可以下調COPD的TGF-β1、IL-8的表達，通過減少炎性細胞因子的釋放，減輕和控制氣道的慢性炎癥反應，進而控制病情的發展，從而治療COPD。

4 參考文獻

1江蘇新醫學院.中藥大辭典(下冊)〔M〕.上海:上海人民出版社，1977:1879.

2中華醫學會呼吸疾病學分會.慢性阻塞性肺疾病(COPD)診治指南〔J〕.中華呼吸和結核雜志，2002;25(8)：453-60.

3韓 玲,許建英.慢性阻塞性肺疾病患者氣道上皮細胞TGF-β1表達的研究〔J〕.山西醫科大學學報,2007；38(2):31-3.

4Tiddens H，Silerman M，Bush A.The role of inflammation in airway disease remodelling〔J〕Am J Cirt Med,2000；162(1):7.

5Jardine H，Mac Nee W，Donaldson K,etal.Molecular mechanism of transforming growth factor(TGF)-beta1-induced glutathione depletion in alveolar epithelial cells.Involvement of AP-1 /ARE and Fra-1〔J〕.J Biol Chem,2002；277(24):21158-66.