胃腺癌患者癌組織中細胞周期素D1、p16及p27蛋白的表達及臨床意義

孫井軍

(中國石化集團勝利石油管理局勝利醫院普外科，山東 東營 257000)

細胞正常生長依賴于細胞周期素(Cyclin)、Cyclin依賴激酶(CDKs)和CDK抑制蛋白的平衡調控〔1〕。Cyclin結合并活化CDKs調節細胞周期中的關鍵節點，使細胞由G1期進入S期〔2〕。機體內同時存在多種CDKs的抑制蛋白，包括p16INK4a、p15INK4b、p18INK4c、p21CIP1和p27KIP1等，抑制細胞由G1期進入S期。由D型Cyclin調控的細胞周期通路是腫瘤細胞中最常見的突變通路〔3〕。CyclinD1過度表達和p16、p27功能喪失會導致細胞過度增殖，誘發腫瘤。本研究旨在探討CyclinD1、p16及p27的表達在胃腺癌的發生發展過程中的作用及其與臨床病理特征之間的關系，評估其作為腫瘤標志物對胃腺癌患者預后的意義。

1 材料與方法

1.1標本來源 我院病理科2008年6月至2013年6月手術切除的原發胃腺癌標本122例，年齡32～79(平均55.6)歲。TNM分期Ⅰ期9例，Ⅱ期35例，Ⅲ期56例，Ⅳ期22例。手術時均未接受過任何放化療。

1.2組織芯片制作 復查所有病例的腫瘤和癌旁HE切片，顯微鏡下選取腫瘤區及癌旁區，用筆圈出采點位置。取每位患者腫瘤組織2個組織點和癌旁組織1個組織點，用組織芯片儀制作成組織芯片蠟塊，共366個位點。芯片蠟塊以5 μm厚度連續切片，進行HE染色，由病理科醫師再次確認病理診斷結果。

1.3免疫組化染色 切片經常規脫蠟至水后，用3%過氧化氫(H2O2)溶液室溫下封閉內源性過氧化物酶20 min后在檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)中進行抗原微波熱修復15 min，待自然冷卻后取出，PBS液洗滌3遍。正常山羊血清封閉30 min后，分別滴加稀釋好的一抗CyclinD1(1∶40)、p16(1∶80)和p27(1∶50)(Santa Cruz公司)，以PBS作為陰性對照，于4℃孵育過夜。采用EnvisionPlus 二抗試劑盒(福州邁新生物技術有限公司)檢測細胞的免疫反應性，操作步驟參照試劑盒說明書。DAB顯色后，經蘇木精負染，脫水透明，中性樹膠封片后光學顯微鏡下觀察。

1.4結果判定標準 CyclinD1陽性著色位于細胞核內，為棕黑色；p16在胞質和胞核內均有表達，主要位于胞核內，為棕黃棕黑色；而p27陽性也是定位于細胞核內，為棕褐色。評分標準參照Zutter等〔4〕的方法稍作改動，取任意5個高倍鏡視野(×400)下的核陽性細胞所占細胞總數比例的平均值為陽性率。陽性率≤5%為陰性(-)，5%～25%為弱陽性(+)，26%～50%為陽性()，>50%為強陽性()。

1.5統計學方法 采用SPSS16.0進行χ2檢驗或Fisher確切概率法和Spearman等級相關。

2 結 果

2.1細胞周期相關蛋白在胃腺癌中的表達 胃腺癌組和癌旁組CyclinD1、p16、p27陽性表達率差異顯著(P<0.01)。見表1和圖1。

表1 CyclinD1、p16和p27蛋白表達在胃腺癌組織和癌旁組織中的表達〔n(%),n=122〕

圖1 CyclinD1、p16和p27蛋白在胃腺癌組織中的陽性表達(EnvisionPlus，×400)

2.2CyclinD1、p16和p27蛋白的表達與患者臨床病理資料的關系 CyclinD1、p16和p27蛋白均與淋巴結轉移有關(P<0.05)。CyclinD1和p16的陽性表達率在低分化與中高分化中有顯著差異(P<0.05)。p16蛋白表達的降低還與腫瘤的浸潤深度有關(P=0.037)。CyclinD1、p16和p27表達均與患者的性別、年齡、腫瘤大小和TNM分期等無明顯關系(表2)。

表2 Cyclin D1、p16和p27蛋白陽性表達與臨床病理資料的關系〔n(%)〕

2.3CyclinD1、p16和p27蛋白在胃腺癌組織中的相關關系 胃腺癌組織中CyclinD1的表達與p16蛋白呈負相關(r=-0.433，P<0.001)；CyclinD1與p27蛋白也呈負相關(r=-0.348，P<0.001)；但p27與p16蛋白之間無明顯的相關關系(r=0.152，P=0.094)。

3 討 論

CyclinD1蛋白作為細胞周期調節蛋白對細胞從G1期進入S期起重要調控作用，其過表達與多種腫瘤的發生發展密切相關〔1,5,6〕。Feakins等〔7〕發現，CyclinD1蛋白陽性表達率在大腸癌與胃癌相似，約為55%，該結果也與本研究結果一致。研究表明，癌旁組織中CyclinD1蛋白表達與患者預后密切相關，癌旁組織中CyclinD1蛋白陽性是腫瘤術后局部復發的一個獨立預后指標〔8〕。本研究結果提示CyclinD1蛋白的過表達與胃腺癌進展和轉移密切相關。

p16蛋白能與CDK4和CDK6特異性結合形成二元復合體，抑制CDK4和CDK6活性，進而抑制Rb蛋白磷酸化〔7〕。Tarakji等〔9〕對癌前多形性腺瘤組織中的p16蛋白檢測發現，癌前多形性腺瘤組織中有81.4%的組織為p16陰性，僅有18.5%呈p16中等強度陽性，表明p16蛋白異常表達在癌前多形性腺瘤的發生發展過程中起重要作用。Motohashi等〔10〕對多種惡性腫瘤細胞系中的p16基因進行檢測發現，p16基因在腫瘤中的突變率可達到30%～80%，可能是p16基因突變失活導致p16蛋白表達量降低或消失。研究表明，口咽部腫瘤患者癌組織中p16蛋白陰性的患者，其預后效果明顯差于p16陽性的患者〔11〕。本研究表明p16蛋白陰性與腫瘤進展和分化密切相關，且預示預后不良。

p27蛋白和p16蛋白同是CDKs的抑制蛋白，對細胞的生長起負調控作用。p27蛋白異常表達與多種腫瘤的預后相關。對于眼瞼皮脂腺癌患者來說，p27陰性是預后不良的重要指標〔12〕，而且其在乳腺癌和結直腸癌中的低表達與低存活率、腫瘤浸潤程度和高死亡率密切相關〔13,14〕。本研究顯示p27表達的消失與胃腺癌轉移有關，但與胃腺癌進展無直接關系。本研究說明當p16蛋白和p27蛋白表達量減少時，CyclinD1蛋白表達量卻升高，使其能與CDK4結合更大程度地結合，促進細胞分裂增殖，進而導致胃腺癌發生和發展。p16蛋白和p27蛋白與CyclinD1蛋白表達的負相關關系可能呈反饋調節關系，參與胃腺癌發生。綜上，CyclinD1和p16、p27對胃腺癌患者的預后評估均具有重要的意義，尤其是p16蛋白。

4 參考文獻

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