脂聯素基因多態性與代謝綜合征和血漿脂聯素水平的相關性

黃鳳珍 劉 軍 龐 棟 卜培莉

(濟南醫院內一科，山東 濟南 250013)

代謝綜合征(MS)有多個易感基因，如脂聯素基因、漿細胞分化抗原-1基因、過氧化酶增殖物激活受體基因等。新近全基因組掃描在染色體3q27區繪制了一個MS的易感位點〔1〕，而編碼脂聯素(APN)的基因正位于此，提示APN基因可能是MS的一個相關基因。國外多項研究發現，APN基因以+45位點(外顯子2)T→G多態性和+276位點(內含子2)G→T多態性相對常見，并證實SNP+45T/G、SNP+276G/T多態性與MS有關，而國內APN基因多態性與MS和APN水平的相關性鮮見報道。本研究探討了APN基因 SNP+45T/G和SNP+276G/T的基因型分布及其與MS和血漿APN水平的關系。

1 資料與方法

1.1研究對象 從本院2 025例老年人中選取年齡、性別匹配的漢族MS組448例，男328例，女120例，年齡65～87〔平均(75.42±3.58)〕歲；正常對照組(NC組)400例，男298例，女102例，年齡66～92〔平均(76.94±2.76)〕歲。MS診斷標準采用IDF(2005)標準，以中心性肥胖(腹圍)為診斷前提，肥胖診斷：腰圍(WC)>90 cm(男)、>80 cm(女)，同時具備以下四項指標中任意兩項：①甘油三酯(TG)≥1.7 mmol/L或已接受治療；②高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)<0.9 mmol/L(40 mg/dl)(男)或<1.1 mmol/L (50 mg/dl)(女)，或已接受治療；③血壓：收縮壓(SBP)≥130 mmHg或舒張壓(DBP)≥85 mmHg，或已接受相應治療或此前已診斷高血壓；④糖代謝異常：空腹血糖(FPG)≥5.6 mmol/L(100 mg/dl)或已接受相應治療或此前已診斷2型糖尿病。NC組為不具備上述5項中的任何一項者。兩組均排除冠心病、肝腎功能異常、腫瘤等疾病。

1.2病史采集、體格檢查 對所有研究對象進行問卷調查，并測量身高、體重、WC、臀圍(HC)、血壓，抽取空腹靜脈血5 ml，其中3 ml用于測血糖、血脂、肝功、腎功，2 ml放入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝試管中,離心分離血漿和血液有形成分在-80℃冰箱保存，供測APN和提取DNA之用。

1.3實驗方法 ①外周血DNA提?。篢IANamp Blood DNA Kit(TIANGEN公司) 提取DNA，DNA保存于-20℃冰箱備用。②聚合酶鏈反應(PCR)擴增：SNP+276位點上游引物為：5′-CTCC TAC ACT GAT ATA AAC TAT ATG AAT-3′，下游引物為：5′-AATG TAC TGG GAA TAG GGA TGA-3′；SNP+45位點上游引物：5′-CTC CCT GTG TCT AGG CCT TAG-3′，下游引物：5′-TAG AAG TAG ACT CTG CTG AGA TG-3′，由博尚生物技術有限公司合成。PCR反應體系：總反應體積25 μl,含DNA模板1 μl，上下游引物各1 μl，2×Taq PCR Master Mix 12.5 μl,ddH2O 9.5 μl,在PCR儀上擴增。PCR程序：SNP+276為預變性94℃ 5 min,循環：變性94℃ 45 s,退火54℃ 45 s，延伸72℃ 30 s，共35個循環，再72℃延伸7 min，4℃保存。SNP+45為預變性94℃ 5 min，循環：變性94℃ 40 s,退火58℃ 40 s，延伸72℃ 45 s，共37個循環，再72℃延伸7 min，4℃保存。PCR產物在2%瓊脂糖凝膠中電泳，溴乙啶染色，自動凝膠成像系統鑒定。③確定基因型 SNP+276：取6 μl PCR產物與1 μl EcoRⅠ(大連寶生物)、10×H buffer 2 μl、ddH2O 11 μl 37℃酶切過夜，2.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴乙啶染色，自動凝膠成像系統鑒定基因型。SNP+45：取6 μl PCR產物與1 μl Sma I(大連寶生物)、10×T buffer 2 μl、0.1% BSA 2 μl、ddH2O 9 μl 30℃酶切4 h，2.5%瓊脂糖凝膠電泳，溴乙啶染色，自動凝膠成像系統鑒定。

1.4統計學方法 用SPSS12.0統計軟件包。均數間比較用t檢驗；直接計數法計算各組等位基因和基因型頻率，組間基因型、等位基因頻率分布比較用pearsonχ2檢驗；遺傳平衡吻合度χ2檢驗群體基因型頻率分布是否符合Hardy-Weinberg平衡定律。

2 結 果

2.1兩組體格檢查及血生化指標比較 兩組比較體重指數(BMI)、SBP、DBP、WC、TG、HDL-C、FPG均有差異(P均=0.000)，見表1。

2.2APN基因SNP+276G/T的電泳分型 PCR擴增結果為245 bp的片段，含T等位基因的片段存在EcoR Ⅰ的酶切位點。當基因型為TT時，酶切產物電泳后出現28 bp和217 bp兩條帶；基因型為GG時，只有245 bp一條帶；基因型為TG時，存在28 bp、217 bp和245 bp三條帶。28 bp片段太小，酶切后顯示不清。見圖1。

2.3APN基因SNP+45T/G的電泳分型 PCR擴增結果為372 bp的片段，經Sma Ⅰ酶切后產生三種基因型：野生型(T/T)，雜合子型(T/G)，純合子突變型(G/G)。含G等位基因的片段被酶切為209 bp和163 bp兩個片段。故若為純合G等位基因，被切為209 bp和163 bp兩個片段；為T、G雜合基因，酶切后有372 bp、209 bp和163 bp三個片段；為純合T等位基因，酶切后只有372 bp一個片段。見圖2。

圖1 APN基因SNP+276 G/T經EcoR Ⅰ酶切圖譜

圖2 APN基因SNP+45 T/G經Sma Ⅰ酶切圖譜

2.4Hardy-Weinberg平衡檢驗 兩組分別進行Hardy-Weinberg平衡吻合度檢驗，P均>0.05，表示兩組樣本均來自遺傳平衡的總體，符合Hardy-Weinberg平衡定律。

2.5APN基因SNP+276G/T基因型與等位基因的分布 兩組在基因型分布上有統計學差異(P<0.05)。MS組T、G等位基因頻率比較有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表1 兩組體格檢查及血生化指標比較±s)

表2 兩組APN基因SNP+276 G/T基因型及等位基因頻率比較〔n(%)〕

2.6APN基因SNP+45T/G基因型與等位基因的分布 兩組在基因型分布上無統計學差異(P﹥0.05)。兩組T、G等位基因頻率比較無統計學意義(P﹥0.05)。見表3。

2.7兩組血漿APN水平比較 分別從MS組、NC組中隨機抽取174例進行血漿APN水平測定，兩組年齡、性別匹配。MS組APN水平均值為(12.57±2.81) μg/ml,NC組為(13.55±1.50) μg/ml，MS組顯著低于NC組(P=0.008)。

2.8男性和女性血漿APN水平比較 整體人群中，男性血漿APN水平均值為(12.88±2.36) μg/ml，女性為(14.33±1.88) μg/ml；MS組中，男性為(12.10±2.93) μg/ml，女性為(13.87±1.72)μg/ml；NC組中，男性為(13.36±1.79) μg/ml，女性為(14.59±1.86) μg/ml，各組男性和女性APN水平比較，女性顯著高于男性(P均<0.05)。校正WC、WHR及HDL-C后，這種差異仍然具有統計學意義(P均<0.05)。

2.9APN基因SNP+45T/G和SNP+276G/T與血漿APN水平之間的關系 SNP+45位點中，TT基因型的APN水平為(12.87±2.42) μg/ml，非TT型為(13.78±2.07) μg/ml，TT基因型顯著低于非TT基因型(P﹤0.05)；SNP+276位點中，GG基因型的APN水平為(13.24±2.30) μg/ml，非GG型為(13.38±2.32) μg/ml，兩者比較無統計學差異(P>0.05)。

表3 兩組APN基因+45 T/G基因型及

2.10MS危險因素Logistic回歸模型 以MS作為因變量，SNP+45和SNP+276位點基因型、年齡、性別、血壓、FPG、BMI等作為自變量，進行多因素逐步Logistic回歸分析，BMI、DBP、FPG、TG、+276位點基因型進入回歸方程，表明SNP+276位點為MS發病的危險因素。見表4。

表4 MS危險因素Logistic回歸分析

3 討 論

MS作為多重心血管危險因素的聚集體，主要臨床表現有腹型肥胖、高血壓、血脂異常、高血糖等，它是引發心腦血管事件的高危因素，也是導致死亡和殘疾的主要原因〔2〕。MS的發病除了環境因素，遺傳因素在發病中的作用已得到證實。MS的患病率在不同人種之間差異顯著，根據世界衛生組織(WHO)標準，20歲以上美國人群的患病率華裔為14%～18%、歐洲裔為24%、阿拉伯和非洲裔為28%、墨西哥裔為38%〔3〕。因此，遺傳因素在MS發生發展中起重要作用，特別是與MS候選基因單核苷酸多態性位點的相關研究是近幾年的研究熱點。胰島素抵抗(IR)是MS的一個重要發病機制，加之基因組掃描連鎖分析發現APN基因所在的人染色體3q27區與MS的多種表型密切相關〔1〕，提示APN基因可能與MS存在某種相關性。對5個不同人種的研究(日本人、德國人、法國人、美國人及瑞典高加索人)都顯示APN基因與IR和MS有關。但是該基因與IR和MS相關的單核苷酸多態性在不同種族報道不一，提示在不同種族之間APN基因改變受遺傳背景和環境因素的共同作用影響。本研究結果顯示，SNP+276G/T與MS的發病相關，GG基因型個體發生MS的危險性高于TT基因型；未發現SNP+45T/G與MS的發病相關。這與Yang等〔4～6〕報道不同，而與高加索人、突尼斯人〔7〕和韓國人〔8〕的研究相似。

自Scherer等〔9〕發現APN以來，對其認識愈來愈深入，它具有改善胰島素敏感性，抗高血糖、抗動脈粥樣硬化等效應。大量臨床研究顯示血漿APN水平與血糖、TG及肥胖程度負相關，與胰島素敏感性和HDL-C正相關〔10～12〕。APN可能通過提高胰島素敏感性、改善糖脂代謝而對上述疾病起到保護作用。

Comuzzie等〔13〕報道血漿APN水平具有很強的遺傳傾向，通過基因組掃描發現了2個主要和4個可能的影響APN水平的區域，其中一個位于3號染色體。此后多個國外研究報道3號染色體APN基因變異與血漿APN水平有關。有研究報道SNP+45位點T和SNP+276位點G等位基因攜帶者血漿APN水平降低〔14，15〕。本研究還表明，血漿APN水平存在明顯的性別差異，女性高于男性，這與大量前期研究結果相符〔16〕。這種性別差異一方面與性激素有關，男性激素對APN基因表達有抑制作用〔17〕；另一方面可能與體脂分布和構成的性別差異有關，并且已有研究表明女性脂肪組織APN表達明顯高于男性〔18〕。本研究顯示血漿APN水平與WC、腰臀比(WHR)負相關，而與HDL-C正相關。

本研究也進一步探討了APN基因+45和+276位點基因多態性與血漿APN水平之間的關系：+45位點TT基因型個體血漿APN水平顯著低于非TT基因型個體，與上述報道相符；+276位點GG基因型個體血漿APN水平與非GG基因型個體相比無統計學差異，與上述報道不符，這可能與種族和地區差異或測定血漿APN水平例數較少有關。

綜上，本研究證實APN基因+276G/T多態性與MS的發病有關，可能是漢族人群發生MS的一個候選基因。而+45T/G多態性與MS的發病可能無相關性。高APN水平可能是MS發病的一個保護性因素，檢測血漿APN有望成為預測MS發生的敏感指標之一。

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