Caspase8及caspase3單核苷酸多態(tài)性與晚期非小細胞肺癌鉑類化療敏感性的相關性

閻 瑾 哈敏文

(遼寧醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腫瘤科，遼寧 錦州 121000)

肺癌的發(fā)生率及死亡率一直居高不下。鉑類藥物作為各種實體瘤治療的有效藥物，同時卻也存在對其敏感性差及副反應不能耐受等諸多問題，究其原因，可能與腫瘤患者的個體差異有關。為了提高療效并降低患者副反應發(fā)生，更進一步發(fā)揮腫瘤患者個體化治療的優(yōu)勢，臨床上迫切需要一個預測因子來平衡化療敏感性與副反應之間的關系。半胱氨酸蛋白酶(caspases)目前確認至少有11種，caspase8參與細胞凋亡的起始，而caspase3執(zhí)行細胞凋亡。caspase是凋亡信號轉導的共同通路，呈“瀑布式”級聯(lián)激活，最終引發(fā)細胞凋亡，其中caspase3起到核心作用。研究顯示caspase家族多個成員的單核苷酸多態(tài)性(SNP)與腫瘤患者的預后及耐藥有關〔1，2〕。本研究通過對晚期非小細胞胞癌(NSCLC)患者caspase8及caspase3的SNP分型，探討其不同基因型與鉑類化療敏感性的關系。

1 材料與方法

1.1研究對象 收集2008年1月至2011年6月在遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院腫瘤內科經細胞學或組織學確診的NSCLC初治患者143例。納入標準：經CT等影像學檢查證實有一處及以上轉移病灶，化療前血常規(guī)及生化檢查指標正常，心電圖正常，功能狀態(tài)(PS)評分0～2分，且均接受含鉑的聯(lián)合化療方案，并有完整的隨訪資料。患者年齡30～83歲，均為中國漢族人；其中，男84例，女59例；鱗癌41例，腺癌88例，其他(腺鱗癌、支氣管肺泡癌)14例；ⅢB期38例，Ⅳ期105例(AJCC2009年分期標準)。

1.2化療方案 所有患者接受含鉑方案化療，具體方案如下：GP 88例，TP/DP 39例，NP 9例，培美曲塞+順鉑7例，具體劑量以體表面積計算。每3～4 w重復1次，所有患者至少完成2個周期化療，平均接受4～6個周期化療。

1.3療效評估與隨訪 根據(jù)實體腫瘤瘤評價標準(RECIST)實體瘤近期客觀療效評價標準，分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、穩(wěn)定(SD)、進展(PD)，通過行胸部增強CT、頭CT，彩超等檢查進行判斷，CR+PR為有效，SD+PD為無效。遠期療效評價指標無進展生存期(PFS)，為患者入組至疾病進展或死亡日期。隨訪時間為患者入組開始化療之日起，每2～3個周期化療后或出現(xiàn)疾病進展相關臨床癥狀時復查，化療結束后每3個月或出現(xiàn)臨床癥狀時復查，直至明確疾病進展，或死亡的日期。隨訪時進行肺CT、頭CT、重要臟器及淋巴結超聲檢查，必要時MRI及PET/CT檢查。所有患者均采用門診或住院隨訪方式。

1.4方法

1.4.1抽提人基因組DNA 收集患者化療前抗凝靜脈血標本，應用天根血基因組DNA提取試劑盒提取外周血基因組DNA。

1.4.2pcr及酶切 pcr反應體系：上下游引物各0.5 μl，基因組DNA 1 μl，pcr mix 3.5 μl，滅菌雙蒸水4.5 μl，共10 μl。94 ℃預變性3 min，94℃ 30 s，退火溫度下30 s，72℃延伸30 s，32個循環(huán)，72℃延伸7 min。取pcr產物5 μl，1.5%瓊脂糖凝膠電泳100 V 40 min見單一清晰條帶。酶切反應體系： pcr產物10 μl，緩沖液2 μl，相應限制性內切酶0.5 μl，滅菌雙蒸水補至25 μl，相應酶切溫度下進行4 h酶切，2.5%瓊脂糖凝膠電泳100 V 60 min驗證酶切結果。caspase8 rs3769818正義:TCTGAGACAACCCATTTACC；反義:AGAATATCATCGCCTCTGAA；退火溫度55℃；pcr產物長度194 bp；限制性內切酶SspⅠ；酶切溫度37℃；rs3834129正義:CTGCATGCCAGGAGCTAAGT；反義:GCCATAGTAATTCTTGCTCTGC；退火溫度58℃；pcr產物長度171/177 bp；限制性內切酶XspⅠ；酶切溫度37℃；caspase3 rs4647693正義:AATTCTGTTGCCACCTTTCG；反義:ACCTTCTGCGTGTTTGCTCT；退火溫度56℃；pcr產物長度443 bp；限制性內切酶BsmAⅠ；酶切溫度55℃。

1.4.3基因測序 將三組pcr產物的基因型各隨機選出3個樣本進行測序，測序工作由上海杰李生物技術有限公司完成。

1.5統(tǒng)計學處理 采用SPSS16.0進行分析，率的比較采用χ2檢驗，生存分析采用Kaplan-Meier法，組間比較采用Log-rank檢驗；對影響生存預后的聯(lián)合效應采用Cox比例風險模型進行多因素分析。

2 結 果

2.13個多態(tài)位點的酶切及測序結果 見圖1～3。

2.2基因型頻率 143例晚期NSCLC患者caspase8及caspase3 3個位點基因頻率見表1。應用Hardy-weinberg定律對其基因型分布進行遺傳平衡檢測，P值均>0.05。故此樣本來自同一孟德爾群體。

2.3caspase8及caspase3 3個位點單核苷酸多態(tài)性與鉑類化療敏感性關系

2.3.1近期療效 caspase3 rs4647693 SNP在近期療效中有顯著差異(P<0.05)，而caspase8 rs3769818和caspase8 rs3834129 SNP無顯著差異(P>0.05)。見表2。

單一194 bp條帶為C/C基因型，194 bp和160 bp為C/T基因型；測序圖為雜合突變

單一171 bp條帶為Del/Del，171 bp和146 bp為Del/Ins，146 bp和31 bp為Ins/Ins；測序圖為Del/Ins突變

單一443 bp條帶為A/A基因型，443 bp、246 bp和197 bp為A/G基因型，246 bp和197 bp為G/G基因型；測序圖為雜合突變

表1 3個位點基因頻率

表2 3個多態(tài)位點基因型與近期療效關系

2.3.2遠期療效 caspase8 rs3769818 C/C基因型晚期NSCLC患者中位PFS長于C/T及T/T基因型者(164 d vs 122 d，P=0.044)；rs3834129 Del/Del基因型者中位PFS長于Del/Ins及Ins/Ins者(164 d vs 152 d，P>0.05)；rs4647693A/A基因型患者中位PFS長于A/G及G/G患者(173 d vs143 d，P=0.013)。見圖4～6。

圖4 rs3769818 C/C基因型與C/T+T/T基因型PFS比較

圖5 rs3834129 Del/Del與Del/Ins+ Ins/Ins基因型PFS比較

進一步采用半參數(shù)分析(COX)回歸模型對可能與PFS相關的7個因素進行多因素分析，顯示性別、年齡、卡氏一般狀況評價量表(KPS)評分和病理類型對無進展生存時間無顯著影響(均P>0.05)。腫瘤分期、caspase8 rs3769818及caspase3 rs4647693 SNP對PFS存在不同程度影響(P<0.05)，因此NSCLC患者的腫瘤分期、caspase8 rs3769818及caspase3 rs4647693共同對鉑類化療的遠期療效起作用，見表3。

圖6 rs4647693 A/A基因型與A/G+G/G基因型PFS比較

表3 COX回歸分析

3 討 論

惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，不僅依賴于細胞增殖速度過快，同樣也依賴于其凋亡的失常。如果細胞的這種程序性死亡的機制受到抑制，則表現(xiàn)出細胞生存期延長，死亡率下降，從而可能轉化為腫瘤。目前研究結果均顯示細胞凋亡對腫瘤發(fā)生發(fā)展起著負調節(jié)作用〔3〕。

晚期NSCLC的治療方案以鉑類為基礎。鉑類藥物的主要作用機制即為誘導細胞凋亡，它與腫瘤細胞的DNA結合，導致DNA鏈間或鏈內交聯(lián)，引起DNA復制及轉錄障礙，從而抑制腫瘤細胞分裂。而其耐藥機制主要為阻礙DNA與鉑類結合和阻礙誘導凋亡，后者包括改變凋亡腫瘤基因的表達、增加DNA修復和減弱其誘導的凋亡等。caspase家族是直接導致凋亡細胞解體的蛋白酶系統(tǒng)，在細胞凋亡過程中起關鍵作用〔4〕。caspase的基因多態(tài)性在多種惡性腫瘤的預后研究中被認為有意義。caspase8定位于染色體2q33，是級聯(lián)反應的啟動因子，rs3769818和rs3834129分別在Son等〔5〕和Sun等〔6〕的研究中被證實與多種腫瘤，如肺癌、食管癌、胃癌及結直腸癌的預后存在關聯(lián)。caspase3是級聯(lián)反應中的效應因子，位于4q34，其多態(tài)性被證實與子宮內膜癌及肺癌有關〔7〕。Stewart〔8〕的研究證明，順鉑可以通過多種途徑來激活caspase8和9，甚至能直接作用于caspase3。因而caspases多態(tài)性所導致的相應蛋白表達改變，就可能間接影響細胞凋亡功能，以致腫瘤對鉑類藥物的敏感性改變。這一點在Kim等〔9〕的研究中得以證明，即在結直腸癌中Caspase8的基因突變后導致細胞凋亡功能的喪失。

Caspase8 rs3769818位于內含子區(qū)，Son等〔5〕在韓國人群中開展的肺癌相關性研究和Zhang等〔10〕關于腫瘤風險的Meta分析中均未體現(xiàn)出顯著性差異。而rs3834129在Sun的中國人群多種惡性腫瘤的研究中，6 bp的缺失被證明降低腫瘤發(fā)病風險，且能降低caspase8的轉錄活性，然而后續(xù)大量實驗卻并未提出相同證據(jù)。caspase3多態(tài)性研究尚少，一項研究中證明其多態(tài)性和單體型與乳腺癌易感性無相關性〔11〕。而國內結直腸癌研究中，caspase3位于啟動子區(qū)的rs4647693多態(tài)性與預后關系亦存在差異〔12，13〕。分析本研究中SNP與PFS存在差異的原因，可能是由于其分別位于基因的內含子區(qū)剪切域附近和啟動子區(qū)，通過影響剪切或基因的轉錄，影響蛋白表達，進而影響細胞凋亡，甚至影響鉑類藥物化療敏感性。進一步的COX回歸模型顯示晚期NSCLC分期和caspase8 rs3769818、caspase3 rs4647693共同影響PFS。

綜上，caspase8 rs3769818和caspase3 rs4647693的單核苷酸多態(tài)性可能是晚期NSCLC鉑類化療敏感性潛在的預測因子。而三者的多態(tài)性是否能作為臨床個體化治療方案選擇的依據(jù)仍需大樣本量、多中心研究進一步證實。

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